Magnetische pincet, een krachtige single-molecule manipulatie techniek kan worden aangepast voor de directe metingen van de twist (met een configuratie genoemd vrij-baan magnetische pincet) en koppel (met een configuratie genoemd magnetisch koppelpincet) in biologische macromoleculen. Richtlijnen voor het uitvoeren van dergelijke metingen worden gegeven, met inbegrip van toepassingen aan de studie van DNA en bijbehorende nucleo-eiwit filamenten.
Single-molecule technieken maken het mogelijk om het gedrag van individuele biologische moleculen in oplossing in real time onderzoeken. Deze technieken omvatten zogenaamde kracht spectroscopie benaderingen zoals atomaire kracht microscopie, optische pincetten, stromen stretching, en magnetische pincet. Onder deze benaderingen, hebben een magnetisch pincet zich onderscheiden door hun vermogen om het koppel te passen met behoud van een constante strekkracht. Hier wordt getoond hoe een dergelijke "klassieke" magnetisch pincet experimentele configuratie, door een eenvoudige wijziging van de veldconfiguratie de omvang van de dwarse veld te minimaliseren, worden aangepast aan de mate van twist in een biologisch molecuul te meten. De resulterende configuratie wordt aangeduid als de vrij-baan om een magnetisch pincet. Bovendien wordt getoond hoe verdere modificatie van veldconfiguratie een transversaal veld kan opleveren met een grootte tussen die van de & #8220; conventionele "magnetische pincet en de vrij-baan magnetische pincet, waardoor het mogelijk rechtstreeks de koppel opgeslagen in een biologisch molecuul. Deze configuratie wordt genoemd de magnetische koppelpincet. De bijhorende video legt uit hoe de conversie van conventionele magnetische pincet in vrij baan om de magnetische pincet en magnetische koppelpincet kan worden bereikt, en toont het gebruik van deze technieken. Deze aanpassingen houden alle sterke punten van de conventionele magnetische pincet terwijl sterk uitbreiden van de veelzijdigheid van dit krachtige instrument.
De afgelopen jaren hebben enkele molecule technieken hun brede toepasbaarheid bewezen in de studie van processive motorische eiwitten en andere enzymen, waardoor inzicht in de kinetiek en de onderliggende mechanochemistry. In het kader van kracht spectroscopie, zijn belangrijke bijdragen zijn gemaakt van atomaire kracht microscopie stroom stretching, en optische en magnetische pincet. Optische en magnetische pincet (MT) hebben met name erin geslaagd een grote flexibiliteit op het gebied van moleculaire manipulatie met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Hier richten we ons op MT, die zowel stretching krachten en momenten kunt toepassen op biologische moleculen gebonden tussen een oppervlak en superparamagnetische 1-3.
Magnetische pincet (MT figuur 1a) is een zeer veelzijdig individuele molecuul techniek die is gebruikt om zowel de mechanische eigenschappen van nucleïnezuren en hun interacties met eiwitten volgen. MT hebben veel sterktes, waaronder de algehele eenvoud en robuustheid van de experimentele uitvoering, gemakkelijke toepassing van het koppel, natuurlijke werking en eenvoudige kalibratie in constante kracht mode 4, uitbreiding van de metingen 5, 6 parallel, en de afwezigheid van het monster verwarming en photodamage. Vergeleken met andere single-molecule komt, MT bieden een manier om kracht-afhankelijkheid metingen uit te voeren op krachten zo laag als ≈ 10 fN en hebben de mogelijkheid om onomwonden de controle van de mate van supercoiling. Terwijl MT zijn voornamelijk gebruikt als een experimenteel middel om biologische processen waarbij nucleïnezuren 7, 8 onderzoeken, hebben zij ook toepassing gevonden in studies van de mechanische eigenschappen van eiwitten 9-13 of cellen 10, 14-17. Talrijke nuttige referenties zijn die beschrijven hoe te bouwen en uitvoeren van een MT 4, 18-20.
Howeveh, conventionele MT niet bijhouden roterende beweging direct, en, terwijl ze het koppel toe te passen, hebben ze geen koppel direct te meten. Verder zij beperken de vrije rotatie van de nucleïnezuur ketting. Hier presenteren we twee uitbreidingen van magneet pincet. De eerste, genaamd vrij-baan magnetische pincet (FOMT, figuur 1b) 21, maakt de metingen van evenwicht hoek fluctuaties en veranderingen in de twist van gebonden nucleïnezuurmoleculen, zonder beperken de rotatiebeweging rond de ketting as. De tweede, zogenaamde magnetische koppelpincet (MTT figuur 1c), die de mogelijkheid om zowel krachten en momenten gelden rechtstreeks meten enkele biomoleculen 22-27 heeft.
In het volgende protocol, veronderstellen we dat de lezer op zijn / haar karakter een 'conventionele' MT instrument. We verwijzen de lezer naar de discussieruimte voor referenties over het opbouwen en uitvoeren van een MT opgezet, evenals ontrantsoenen dat bij de selectie van magnetische korrels, magneten, en volgen routines rekening moet worden gehouden. Bovendien delen 1 en 2 van het protocol tekst beschrijven hoe wij doorgaans bereiden en incubeer een DNA monster voor gebruik in de MT en de voorlopige metingen die worden uitgevoerd op een enkel DNA in de conventionele MT. Paragrafen 3 en 4 van het Protocol tekst illustreren hoe een MT instrument gemakkelijk kan worden aangepast en gebruikt voor FOMT en MTT metingen.
Bij het uitvoeren van experimenten met de MTT of FOMT moeten een aantal keuzen inzake kralen, magneten, volgen protocollen, etc. De beste keuzes worden gemaakt afhankelijk van het experiment plaats. De trade-offs die verschillende keuzes begeleiden Hieronder beschrijven we die keuze voor een bepaald experiment dient te vergemakkelijken. Vervolgens beschrijven we een aantal cruciale stappen die de afstemming en uitvoering van MTT en FOMT experimenten te begeleiden. Tot slot bespreken we de betekenis van de MTT en FOMT met betrekking tot bestaande methoden en toekomstige toepassingen.
Overwegingen Voorafgaand aan de start van MTT en FOMT Experimenten
Elk experiment vereist dat men een soort magnetische beads voor gebruik te selecteren. Men kan kiezen tussen verschillende commercieel verkrijgbare-streptavidine beklede superparamagnetische, bijvoorbeeld, 0,25 micrometer straal kralen, 0,5 micrometer straal kralen, of 1,4 micrometer straal kralen (see tafel Materials). Grotere beads een verhoogd magnetisch moment hebben vergeleken met kleinere korrels (ongeveer schaling als volume) en daarom zal het gebruik van de toepassing van hogere krachten vergemakkelijken (voor typische krachten bereikt onze instrumenten, zie tabel 1). Bij hoekige volgen met behulp van markering kralen gewenst is, we werken meestal met 1,4 micrometer straal en gebruiken 0,5 micrometer straal niet-magnetische gebiotinyleerd kralen als marker kralen (zie paragraaf 1.9 voor de bijbehorende bijlage protocol). Het gebruik van kleinere korrels wordt bijzonder aanbevolen voor de FOMT, zoals de karakteristieke tijdschaal voor kraal rotatie τ C gelijk aan de verhouding van de weerstand van het systeem ten opzichte van zijn veerconstante γ / k θ; Belangrijker, de rotatie weerstandscoëfficiënt relevant voor de hoekmeting tijdschaal schalen als ~ R kraal 3, dus met de derde macht van de straal (zie Tabel 2 voorde karakteristieke tijdschalen voor verschillende kraal-DNA combinaties in FOMT en MTT metingen). Begeleidende verlaging van de maximale kracht die kan worden toegepast kan worden aangepakt met een omgedraaid stapel cilindrische magneten 27. Niettemin, in FOMT metingen kan het soms nodig zijn om compromissen te sluiten tussen de best haalbare temporele resolutie en de maximale uitgeoefende kracht.
Daarnaast werd een experiment vereist de keuze van een magneet configuratie. In de conventionele magnetische pincet configuratie (figuur 1a), we gebruiken meestal een paar van 5x5x5 mm kubieke magneten in verticale richting met een 0,5 of 1 mm tussen de magneten 4. Wanneer de magneten zijn verdeeld langs de x (y-as), dit levert een magnetisch veld die primair gericht langs de x (y). Voor FOMT experimenten wordt een cilindervormige magneet gekozen waarvan het middelpunt het magneetveld primair gerichtlangs de z-as (Figuur 1b). In de praktijk gebruiken we een stapel van drie dergelijke cilindervormige magneten, elk met een diameter van 6 mm en 2 mm centraal gat, voor een totale dikte van 6 mm. Wanneer hogere trekkrachten gewenst zijn, wordt een "omgedraaid stack" magneet configuratie waarin de onderste magneet wordt gestapeld met tegengestelde magnetisatie voorkeur. De MTT configuratie (figuur 1c) bereiken, voegen we een magneet aan de kant van de magneet stapel de FOMT configuratie, meestal een massieve cilinder met 4 mm diameter en een hoogte van 7 mm. Om te zien hoe de maximale krachten bereikt onze instrumenten afhankelijk van de magneetconfiguratie, zie Tabel 1.
Het op elkaar afstemmen van MTT en FOMT Experimenten
Aangezien magnetische kralen hebben een (ongeveer) gelijkmatig gefunctionaliseerde oppervlak (meestal streptavidine) en sinds de bevestiging van zowel de gefunctionaliseerde nucleic zuur aanbinden en marker kralen (in het geval de marker-bead based hoekig opsporing wordt gebruikt) gebeurt via eenvoudige incubatie in oplossing is, is men niet bepalen waar de ketting en / of marker kraal hechten aan het magnetische bolletje. De magnetische kralen hebben een voorkeur magnetisatie-as die de neiging in de richting van het externe veld uitlijnen. Als we geven de punten waar de voorkeur magnetisatie snijdt het oppervlak van de kraal als de noord-en zuidpool, dan kralen waar de DNA-tether dicht bij de evenaar is aangesloten zal sporen uit een cirkelvormige ring met een straal dichtbij of iets groter dan de kraal straal in het FOMT; daarentegen zal kralen die dicht bij de zuidpool zijn bevestigd fluctueren op een ronde ring met een zeer kleine radius in de FOMT, die het aanbrengen van de cirkel met behulp van vergelijkingen 3-5 kunnen uitsluiten. We merken op dat bij gewone sferische geometrie, de waarschijnlijkheid van het bevestigen nabij de evenaar is veel groter dan een bijlage precies op de polen; Daarom zijn de meeste bEADS worden aangebonden zodat de (x, y)-gebaseerde hoekige volgen succes kan worden uitgevoerd.
Een soortgelijke redenering geldt voor de bevestiging van de marker kralen voor de referentiemerkteken gebaseerd hoekige tracking. De marker kraal wordt gebruikt om een asymmetrie in het beeld van de magnetische kraal die hoek volgen mogelijk maakt creëren. Als de marker kraal precies wordt bevestigd aan de noord-of zuidpool van de kraal (dwz direct boven of op de bodem), het resulterende beeld is nog steeds draaisymmetrische en de hoekige volgen protocol mislukt. Echter, door dezelfde sferische geometrie argument, de kans op een marker kraal direct bij een van de polen hechten relatief klein is; we vinden dat in de praktijk de meeste marker kralen geven een voldoende asymmetrie te hoekig bijhouden schakelen. Tenslotte merken we op dat de conventionele magnetische pincet het gebied richting de (x, y)-vlak; daarom zal de voorkeur magnetisatie-as van de kraal uitlijnen the (x, y)-vlak en de noord-en zuidpolen, zoals boven gedefinieerd, zullen worden aan de zijkanten van de hiel, waarschijnlijk de situatie in de FOMT of MTT, waarbij de polen aan de boven-en onderkant.
In FOMT experimenten, een cruciale stap is de uitlijning van de cilindrische magneet, zodat het radiale magneetveld verwaarloosbaar nabij de hiel. Deze uitlijning wordt uitgevoerd voor een kraal per keer. Om te beoordelen of kraal beweging in de FOMT gelijkmatig wordt verdeeld over een cirkelvormige ring, moet de meettijd meer bedragen dan 20 · τ C. Als τ C is gelijk aan ~ 45 sec voor 8 kbp DNA en een 0,5 mm radius kraal, de meettijd is ~ 900 sec in de laatste fase van de aanpassing. Ter vergelijking, gebruik van 1,9 kbp DNA en 0,25 mm radius kralen vermindert τ C twintigvoudige naar ~ 2 seconden (zie ook tabel 2).
Kritische stappen en overwegingen voor Tracking Tijdens FOMT en MTT Experimenten
De kraal in-plane schommelingen volgen, namelijk de (x, y)-positie, gebruiken we een kruiscorrelatie analyse van de intensiteit profielen weergegeven door een kraal op latere tijdstippen 35, 36. Dit kan bij sub-pixel resolutie met een nauwkeurigheid van enkele nanometers 20 uitgevoerd. Om beweging van de kraal in z volgen, wij gebruiken meestal een methode eerst gemaakt door Gosse en kroket, waarbij brandvlak van de doelstelling van (OFP) nauwkeurig verschoven in verticale richting, terwijl beeldvorming van de diffractie ringen van de hiel aan de nucleïnezuur 20 . Op deze wijze wordt een kalibratie-profiel gegenereerd correleren van het diffractiepatroon van de kraal om de afstand tussen de hiel en de OFP 19. Wanneer deze manier bereikt wordt geïnterpoleerd, kan de verticale verplaatsing van de kraal worden gemeten met een nauwkeurigheid tot een paar nm 20.We verwijzen de lezer naar aanvullende referenties die meer verfijnde volgen algoritmen 37, 38 en de toepassing daarvan op het volgen van meerdere kralen 5, 6, 37 parallel te beschrijven.
Bij het gebruik van hoekige tracking die is gebaseerd op de omzetting van (x, y)-posities in hoekige coördinaten, adviseren wij als volgt te werk. Uit een tijd trace waarbij de kraal sporen uit een cirkelvormige ring, gebruik maken van de (x i, y i) posities (waarbij de index i duidt daarop volgende meetpunten) aan de cirkel middelpunt (x 0, y 0) en straal R cirkel passen (Figuur 2a) door het minimaliseren:
(3)
waarbij de som loopt over alle datapunten. Na fitting x 0, y 0, en R cirkel, bepalen de polaire coördinaten (r i, θ i) van elk gegeven punt in de tijd te traceren:
(4)
(5)
Merk op dat men moet zorgen voor "uitpakken" de hoek θ, dwz fasesprongen van ± π waar nodig toe te voegen. Op maat geschreven code voor de montage en conversie van (x, y) (r, θ) coördinaten is verkrijgbaar bij de auteurs op aanvraag. In de FOMT, kan een time trace waarbij de kraal sporen uit een cirkelvormige ring worden verkregen door het bereiken van grove uitlijning (zie stap 3.3) en het opnemen van de thermische fluctuaties van de kraal. In de MTT, thermische fluctuatiesaties zijn onvoldoende op te sporen uit de cirkelvormige ring; in plaats daarvan gebruik van een time trace waar de magneten zijn langzaam (typisch bij 0,1 Hz) gedraaid door verschillende slagen om de cirkel te passen met behulp van vergelijkingen 3-5.
Wij merken op dat de MTT, is het belangrijk om de juiste hoek volgen benadering, namelijk via een hoekige volgen merker (Figuur 1c Figuur 1d, figuur 3a) of via de omzetting van (x, y)-posities in hoekige coördinaten kiezen ( Figuur 1d, Figuur 2b). Terwijl gewoonlijk de nauwkeurigheid van de hoekige bijhouden van (x, y)-posities en het gebruik van merker kralen vergelijkbaar, is het belangrijk te realiseren dat overspraak optreedt tussen schommelingen een kraal in (x, y) en de hoek, zoals beschreven in Janssen et al. 32: zo hoekige volgen van (x, y)-posities is alleen geldig indien de Brownse fluctuaties in (x, Y) dragen slechts verwaarloosbaar aan de onzekerheid in de hoekcoördinaat en het juiste gebruik van (x, y)-volgen kan afstemming van de rotatie val stijfheid vereisen via aanpassing van de positie van de zij magneet. Typisch, het gebruik van hogere val stijfheid vereist het gebruik van hoekige volgen met behulp van markering kralen. Het gebruik van de marker kralen vereist een extra bevestiging stap, die het aantal bruikbare aanbinden kan verminderen (zie de bijlage protocol in stap 1.9). Wanneer de merker-kraal gebaseerd volgend, is het belangrijk om magnetische korrels die een marker kraal rond de evenaar verbonden voor beste resultaten.
Betekenis van de FOMT en MTT Benaderingen Vergeleken met bestaande methoden en toepassingen
In het bovenstaande hebben we aangetoond hoe men, uitgaande van conventionele MT, de magneet configuraties gemakkelijk aanpassen om het instrument te zetten in MTT of FOMT. Deze eenvoudige mIJZIGING, eventueel parallel met de invoering van hoekige volgen wanneer het gebruik van een hoekige volgen marker gewenst, een onmiddellijke sterk punt van beide configuraties, omdat het toelaat de gebruiker om torsie passen, meten koppel of maatregel draai afhankelijk experimenteren bij de hand. Zoals vermeld in de inleiding, zowel FOMT en MTT profiteren van veel van de bestaande sterke punten van MT, met name hun eenvoud, met de MTT in het bijzonder ook profiteren van de mogelijkheid van parallelle metingen 5, 6 (deze zijn niet zo gemakkelijk te realiseren in FOMT gegeven de vereiste uitlijning van de ketting ten opzichte van het midden van de cilindrische magneet). Met name hebben MTT en FOMT vereisen, in tegenstelling tot andere technieken, speciaal vervaardigd nano deeltjes 22, 39, 40, complexe optische ontwerp 41, of het introduceren van extra korrels binnen het gebonden (DNA) molecuul 42. Dergelijke other technieken kunnen echter zorgen voor andere voordelen zoals hogere temporele resolutie 27, 43, 44. Zowel FOMT en MTT moeten toekomstige toepassingen in de studie van genoom verwerking vinden, zoals het gedrag van moleculaire motoren op DNA zowel door en heeft gevolgen voor de lokale twist en koppel. Extra toepassingen zijn te vinden in de opkomende gebied van DNA nanotechnologie 27 of in het bredere gebied van roterende motoren actief in biologische verwerking 7, 45.
M270 (R kraal = 1,4 micrometer) | MyOne (R bead = 0,5 pm) | Ademtech (R kraal = 0,25 pm) | |
Conventionele MT (paar kubieke 5 x 5 x 5 mm 3 magneten, 1 mm tussenruimte, verticale uitlijning) | 70 pN | 8 pN | 1.6 pN |
FOMT of MTT * (stapel van drie cilindrische magneten, 6 mm, 2 mm tussenruimte diameter) | 9 pN | 1 pN | 0.2 pN |
FOMT of MTT * (stack van drie cilindrische magneten, 6 mm diameter, 1 mm gat diameter) | 18 pN | 2 pN | 0.4 pN |
FOMT of MTT * (stapel van drie cilindrische magneten met laatste omgedraaid, 1 mm gat diameter) | ~ 50 pN | 9 pN | 1.8 pN |
* De aanwezigheid van de kleine kant magneet in de MTT heeft een verwaarloosbaar effect op de rekkracht
Tabel 1. Maximum krachten doorgaans bereikt voor verschillende magneetconfiguraties en modellen kraal.
R kraal = 1,4 micrometer | R = 0,5 urn kraal | R kraal =0.25 pm | |
Wrijvingscoëfficiënt * | 120 pN · nm · sec | 5.5 pN · nm · sec | 0.7 pN · nm · sec |
Karakteristieke tijdschaal: FOMT, 10 kbp DNA ** | 1.200 sec | 55 sec | 7 sec |
Karakteristieke tijdschaal: FOMT, 1 kbp DNA | 120 sec | 5.5 sec | 0.7 sec |
Karakteristieke tijdschaal: MTT, k q = 100 pN · nm / rad | 1.2 sec | 0.06 sec | 0.007 sec |
Karakteristieke tijdschaal: MTT, k q = 1000 pN · nm / rad | 0.12 sec | 0.006 sec = 6 msec | 0,0007 s = 0,7 msec |
* Wrijvingscoëfficiënt voor rotatie om een as door de "evenaar" (dat wil zeggen de in figuur 1b situatie), Die door 14 · p · h · R kraal 3, waarin h de viscositeit van de buffer.
** In de FOMT, de rotatie val stijfheid wordt gegeven door de torsiestijfheid van het DNA, k q, DNA = C k B T / L C, waarbij C de effectieve torsie persistentielengte, aangenomen · 80 nm here ( die kenmerkend een tussenproduct kracht regime F ~ 1 pN) en L C is de omtrek lengte van DNA, 0,34 nm per basepaar.
Tabel 2. Friction coëfficiënten en karakteristieke tijdschalen voor FOMT en MTT.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de TU Delft, de Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO), de Stichting voor Fundamenteel Onderzoek der Materie, en door de European Science Foundation.
Sandblaster | Great Lake Orthodontics | 190-070 Microetcher II | |
Nitrocellulose | Life Technologies | LC2001 | |
Magnetic particle concentrator | Life Technologies | 12002D | |
Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) | Polysciences | 17010 | |
Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) | Sanbio | PV05N/2179 | |
Antidigoxigenin | Roche | 11 214 667 001 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) | Ademtech | 3150 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) | Life Technologies | 650.01 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) | Life Technologies | 653.05 | |
Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) | Life Technologies | F-8768 | |
Cubic magnets for conventional tweezers | Supermagnete | W-05-N50-G | |
Cylindrical magnet for MTT and FOMT | Supermagnete | R-06-02-02G | |
Side magnet for MTT | Supermagnete | S-04-07-N | |
Linear stage | Physik Instrumente | M-126.PD | |
Rotary stage | Physik Instrumente | C-150 | |
High-resolution automated sample stage | Physik Instrumente | P-733.2D | |
Software for coding analysis routines | The Mathworks | Matlab | custom-written routines are available from the authors |