Pinzas magnéticas, una técnica de la manipulación de una sola molécula de gran alcance, pueden ser adaptadas para las mediciones directas de la torsión (usando una configuración llamada libremente en órbita alrededor de pinzas magnéticas) y el par (usando una configuración denominado pinzas de par magnético) en macromoléculas biológicas. Se dan directrices para efectuar estas mediciones, incluidas las aplicaciones para el estudio de ADN y filamentos de núcleo-proteínas asociadas.
Técnicas de una sola molécula permiten investigar el comportamiento de las moléculas biológicas individuales en solución en tiempo real. Estas técnicas incluyen los denominados enfoques de espectroscopia de fuerza tales como microscopía de fuerza atómica, pinzas ópticas, el flujo de estiramiento, y pinzas magnéticas. Entre estos enfoques, pinzas magnéticas se han distinguido por su capacidad para aplicar torque, mientras que el mantenimiento de una fuerza de estiramiento constante. Aquí, se ilustra cómo una configuración experimental de pinzas magnéticas "convencional" puede, a través de una modificación sencilla de su configuración de campo para reducir al mínimo la magnitud del campo transversal, ser adaptado para medir el grado de torsión en una molécula biológica. Tales La configuración resultante se denomina las pinzas magnéticas libremente-en órbita. Además, se muestra cómo la modificación adicional de la configuración del campo puede producir un campo transversal con una magnitud intermedia entre la de la & #8220; "pinzas magnéticas convencionales y las pinzas magnéticas libremente-que orbitan, lo que hace posible medir directamente el par almacenada en una molécula biológica. Esta configuración se denomina las pinzas par magnético. El vídeo que acompaña explica en detalle cómo la conversión de pinzas magnéticas convencionales en libremente en órbita alrededor de pinzas magnéticas y pinzas de par magnético se puede lograr, y demuestra el uso de estas técnicas. Estas adaptaciones mantienen todos los puntos fuertes de pinzas magnéticas convencionales mientras se expande en gran medida la versatilidad de este instrumento poderoso.
En los últimos años, las técnicas de una sola molécula han demostrado su amplia aplicabilidad en el estudio de las proteínas motoras processive y otras enzimas, dando una idea de su cinética y la mecanoquímica subyacente. En el contexto de espectroscopia de fuerza, importantes contribuciones han sido hechas por microscopía de fuerza atómica flujo de estiramiento y pinzas ópticas y magnéticas. Las pinzas ópticas y magnéticas (MT) en particular han logrado combinar una gran flexibilidad en cuanto a manipulación molecular con una alta resolución espacial y temporal. Aquí, nos centramos en MT, que se puede aplicar tanto a las fuerzas de estiramiento y los pares de moléculas biológicas atados entre una superficie y perlas superparamagnéticas 1-3.
Pinzas magnéticas (MT, Figura 1a) son una técnica de una sola molécula muy versátil que se ha utilizado para controlar tanto las propiedades mecánicas de los ácidos nucleicos, así como sus interacciones con las proteínas. MT tiene muchas fuerzass, incluyendo simplicidad y robustez general de la implementación experimental, aplicación fácil de par motor, la operación de calibración natural y sencilla en el modo de fuerza constante 4, la extensión a paralelo mediciones 5, 6, y la ausencia de calentamiento de la muestra y fotodaño. En comparación con otros enfoques de molécula única, MT proporciona una forma para llevar a cabo mediciones de la fuerza de dependencia a fuerzas tan bajas como ≈ 10 FN y tener la capacidad de controlar sin rodeos el grado de superenrollamiento. Mientras MTs predominantemente se han utilizado como una herramienta experimental para investigar los procesos biológicos que implican ácidos nucleicos 7, 8, que también han encontrado aplicación en estudios de las propiedades mecánicas de las proteínas de 9-13 o células 10, 14-17. Numerosas referencias útiles están disponibles que describen cómo crear y ejecutar una MT 4, 18-20.
Sin emer, MT convencional no rastrear el movimiento de rotación directamente, y, si bien se aplican par, no miden directamente el par. Además, restringen la rotación libre de la correa de sujeción de ácido nucleico. A continuación, presentamos dos extensiones de pinzas magnéticas. Las primeras pinzas magnéticas, denominados libremente en órbita alrededor de (FOMT, Figura 1b) 21, permite las mediciones de las fluctuaciones y los cambios en el giro de las moléculas de ácido nucleico atados ángulo de equilibrio, sin restringir el movimiento de rotación alrededor del eje de sujeción. El segundo, denominado pinzas par magnético (MTT, la Figura 1c), que tiene la capacidad de aplicar y medir directamente las fuerzas y pares de torsión a las biomoléculas individuales 22-27.
En el siguiente protocolo, se presumirá que el lector tiene a su / su disposición un instrumento MT "convencional". Remitimos al lector a la discusión de las referencias sobre cómo construir y ejecutar una MT establecido, así como consiraciones que deben ser tomados en cuenta en la selección de los granos magnéticos, los imanes, y rutinas de seguimiento. Además, las secciones 1 y 2 del Protocolo texto describen la forma en que suelen preparar e incubar una muestra de ADN para su uso en la MT, así como las medidas preliminares que se pueden realizar en un solo ADN en la MT convencional. Las secciones 3 y 4 del Texto Protocolo ilustran cómo un instrumento MT puede ser adaptado y utilizado para las mediciones FOMT y MTT fácilmente.
Al ejecutar experimentos utilizando el MTT o la FOMT, una serie de opciones deben hacerse con respecto perlas, los imanes, los protocolos de seguimiento, etc Los mejores decisiones que tomar dependerán del experimento de interés. A continuación, se describen las ventajas y desventajas que acompañan a las diferentes opciones, lo que debería facilitar la selección para un experimento particular. A continuación se describen varios pasos críticos que acompañan a la alineación y el funcionamiento de las MTT y FOMT experimentos. Por último, se discute la importancia de la MTT y FOMT con respecto a los métodos existentes, así como futuras aplicaciones.
Consideraciones antes del inicio de MTT y FOMT Experimentos
Cualquier experimento requiere que se seleccione un tipo de perla magnética para su uso. Se puede seleccionar entre varias cuentas disponibles comercialmente recubiertas de estreptavidina superparamagnéticas, por ejemplo, 0,25 micras perlas radio, 0.5 micras cuentas RADIUS o 1,4 micras cuentas de radio (see la tabla de Materiales). Perlas más grandes tendrán un mayor momento magnético en comparación con los granos más pequeños (aproximadamente de escala como el volumen) y por lo tanto su uso facilitará la aplicación de fuerzas superiores (por fuerzas típicos obtenidos en nuestros instrumentos, véase el cuadro 1). Cuando se desea el seguimiento angular utilizando cuentas de marcadores, por lo general trabajamos con 1,4 m de radio y el uso de 0,5 m de radio perlas biotina no magnéticos como perlas marcadoras (véase el párrafo 1.9 para el protocolo adjunto correspondiente). El uso de los granos más pequeños se recomienda especialmente para la FOMT, como escala de tiempo característica para τ rotación de cuentas C es igual a la proporción de arrastre del sistema a través de su resorte constante γ / k θ; importante, el coeficiente de arrastre de rotación relevante para las escalas de escala de tiempo de medición angular que R ~ 3 del talón, es decir, con la tercera potencia del radio (ver Tabla 2 para losel tiempo característico escalas por varias combinaciones de ADN del grano en FOMT y mediciones MTT). Reducciones acompañante en la fuerza máxima que puede ser aplicada puede dirigirse mediante el uso de una pila volteado de imanes cilíndricos 27. Sin embargo, en mediciones FOMT a veces puede ser necesario un compromiso entre la mejor resolución temporal alcanzable y la fuerza máxima aplicada.
Además, un experimento requiere la selección de una configuración de imán. En la configuración de pinzas magnéticas convencionales (Figura 1a), por lo general usamos un par de 5x5x5 mm imanes cúbicos en orientación vertical con un espacio de 0,5 o 1 mm entre los imanes 4. Cuando los imanes están espaciados a lo largo del eje x (y), esto produce un campo magnético que se dirige principalmente a lo largo del eje x (y). Para los experimentos de FOMT, se selecciona un imán de forma cilíndrica en cuyo centro el campo magnético se dirige principalmentea lo largo del eje z (Figura 1b). En la práctica, se utiliza una pila de tres de tales imanes de forma cilíndrica, cada uno con un diámetro de 6 mm y un orificio central 2 mm de diámetro, para un espesor total de 6 mm. Cuando se desean fuerzas de tracción superiores, se prefiere una configuración imán "pila volteada" en el que el imán inferior está apilado con magnetización opuesta. Para lograr la configuración de MTT (Figura 1c), añadimos un imán adicional para el lado de la pila principal imán de la configuración FOMT, típicamente un cilindro sólido con 4 mm de diámetro y una altura de 7 mm. Para ver cómo las fuerzas máximas alcanzadas en nuestros instrumentos dependen de la configuración del imán, ver Tabla 1.
La alineación de MTT y FOMT Experimentos
Desde perlas magnéticas tienen una superficie funcionalizada de manera uniforme (aproximadamente) (típicamente estreptavidina) y dado que el accesorio de tanto el n funcionalizadocorreas de ácido ucleic y perlas de marcador (en caso de que se emplea el marcador de seguimiento angular basado en perlas) se produce a través de simple incubación en solución, uno no controla donde la correa de sujeción y / o perla marcador se unen a la perla magnética. Las perlas magnéticas tienen un eje de magnetización preferido que tiende a alinearse a lo largo de la dirección del campo externo. Si denotamos los puntos donde el eje de magnetización preferente intersecta la superficie de la perla como los polos norte y sur, a continuación, los granos, donde el ADN de la correa se une cerca del ecuador se trazará un anillo circular con un radio de cerca o ligeramente mayor que el radio del talón en la FOMT; en contraste, los granos que se unen cerca del polo sur fluctuarán en un anillo circular con radio muy pequeño en el FOMT, lo que puede impedir montaje del círculo usando las ecuaciones 3-5. Observamos que por la geometría esférica sencilla, la probabilidad de fijación cerca del ecuador es mucho más grande que un archivo adjunto exactamente en los polos; Por lo tanto, la mayor parte bserán atados eads de tal manera que el seguimiento angular (x, y) basado en la puede llevar a cabo con éxito.
Un argumento similar es válido para la fijación de las perlas de marcadores para el marcador de seguimiento basada angular fiducial. El cordón marcador se utiliza para crear una asimetría en la imagen de la perla magnética que permite el seguimiento de ángulo. Si el cordón de marcador se une exactamente al norte o al polo sur de la perla (es decir, directamente en la parte superior o en la parte inferior), la imagen resultante es todavía simetría de rotación y no el protocolo de seguimiento angular. Sin embargo, por el mismo argumento geometría esférica, la posibilidad de un cordón marcador para conectar directamente a uno de los polos es relativamente pequeña; nos encontramos con que en la práctica la mayoría de las perlas de marcadores dan una asimetría suficiente para habilitar el seguimiento de angular. Por último, observamos que en las pinzas magnéticas convencionales la dirección del campo es en el (x, y) del plano; Por lo tanto, el eje de magnetización preferidas de la perla se alinearán en the (x, y) del plano y los polos norte y sur, como se definió anteriormente, van a estar en los lados de la perla, poco probable que la situación en el FOMT o MTT, donde los polos están en la parte superior e inferior.
En experimentos FOMT, un paso crítico es la alineación del imán cilíndrico de tal manera que el campo magnético radial es despreciable en proximidad a la perla. Esta alineación se lleva a cabo para una única perla a la vez. Para juzgar si el movimiento del talón en la FOMT se distribuye uniformemente sobre un anillo circular, el tiempo de medición debe exceder de 20 · C τ. Como τ es igual a C ~ 45 seg de 8 kpb de ADN y un cordón de 0,5 mm de radio, el tiempo de medición es de ~ 900 segundos en la etapa final de la alineación. Para la comparación, el uso de 1,9 kpb de ADN y 0,25 mm perlas de radio reduce τ C veinte veces a ~ 2 seg (ver también la Tabla 2).
Etapas críticas y Consideraciones para el seguimiento Durante FOMT y MTT experimentos
Para el seguimiento de las fluctuaciones del grano en el plano, es decir, su (x, y)-posición, empleamos un análisis de correlación cruzada de los perfiles de intensidad mostrados por un cordón a intervalos de tiempo posteriores 35, 36. Esto puede llevarse a cabo a la resolución sub-píxel con una precisión de unos pocos nanómetros 20. Para seguir el movimiento del talón en Z, que normalmente utilizan un método primera diseñada por Gosse y croqueta, en el que el plano focal del objetivo (OFP) se desplaza con precisión en la dirección vertical mientras que las imágenes de los anillos de difracción de la perla unido al ácido nucleico 20 . De esta manera, un perfil de calibración se genera correlacionar el patrón de difracción de la perla a la distancia entre el talón y la OFP 19. Cuando se interpola este perfil de calibración, los desplazamientos verticales de la perla pueden ser también midieron con una precisión de hasta unos pocos nm 20.Remitimos al lector a las referencias adicionales que describen los algoritmos más refinados de seguimiento de 37, 38, así como su aplicación en paralelo de seguimiento de múltiples cuentas de 5, 6, 37.
Cuando se utiliza el seguimiento angular que se basa en la conversión de (x, y) las posiciones en coordenadas angulares, le aconsejamos seguir los siguientes pasos. A partir de una curva del tiempo en el que el cordón traza un anillo circular, utilice el (x i, y i) posiciones (donde el índice i indica puntos de valoración posterior) para encajar el centro del círculo (x 0, y 0) y el radio del círculo R (Figura 2a), reduciendo al mínimo:
(3)
donde la suma se extiende sobre todos los puntos de datos. Después fitting x 0, y 0, y R círculo, determinar las coordenadas polares (r i, θ i) de cada punto de datos en la curva del tiempo usando:
(4)
(5)
Tenga en cuenta que se debe tener cuidado para "desenvolver" el ángulo θ, es decir, añadir saltos de fase de ± π en su caso. Código escrito por encargo para el ajuste y la conversión de (x, y) a (r, θ) en coordenadas está disponible a partir de los autores que lo soliciten. En la FOMT, un tiempo de seguimiento en la que el cordón de traza un anillo circular puede obtenerse a través de la consecución de alineación aproximada (véase paso 3.3) y el registro de las fluctuaciones térmicas de la perla. En el MTT, fluctuación térmicaciones son insuficientes para trazar el anillo circular; en su lugar, utilizar una curva del tiempo en que los imanes son lentamente (por lo general en el 0,1 Hz) girado por varias vueltas para adaptarse al círculo usando las ecuaciones 3-5.
Observamos que para el MTT, es importante elegir el enfoque adecuado de seguimiento angular, es decir, a través de un marcador de seguimiento angular (Figura 1c, Figura 1d, Figura 3a) o a través de la conversión de (x, y)-posiciones en coordenadas angulares ( la Figura 1d, Figura 2b). Aunque normalmente la precisión de la seguimiento angular desde (x, y)-posiciones y el uso de perlas de marcadores son comparables, es importante darse cuenta de que la diafonía se produce entre las fluctuaciones de un cordón en (x, y) y en ángulo, como se describe en Janssen et al 32: por lo tanto, el seguimiento angular desde (x, y)-posiciones sólo es válido a condición de que las fluctuaciones browniano en (x, Y) contribuyen sólo insignificantemente a la incertidumbre en la coordenada angular, y su uso apropiado de (x, y)-seguimiento puede requerir un ajuste de la trampa de rigidez rotacional a través de ajuste de la posición del imán lado. Típicamente, el uso de la trampa de mayor rigidez requiere el uso de seguimiento angular usando perlas de marcadores. El uso de perlas de marcadores requiere un paso de fijación adicional, que puede reducir el número de ataduras utilizables (véase el protocolo adjunto en el paso 1.9). Cuando se utiliza el seguimiento basado en perlas marcador, es importante seleccionar perlas magnéticas que tienen un cordón marcador está unido cerca del ecuador para obtener mejores resultados.
Importancia del FOMT y MTT Enfoques comparación con los métodos y aplicaciones existentes
En lo anterior, hemos demostrado cómo se puede, a partir de MT convencional, modificar fácilmente las configuraciones de imán para convertir el instrumento en MTT o FOMT. Este sencillo mODIFICACIÓN, que puede estar acompañada de la introducción de seguimiento angular cuando se desea el uso de un marcador de seguimiento angular, es un punto fuerte de ambas configuraciones inmediata, ya que permite que el usuario aplique par de torsión, medir el par, o medir el giro en función de la experimentar a la mano. Como se mencionó en la introducción, tanto FOMT y MTT se benefician de muchas de las fortalezas existentes de MT, en particular su simplicidad, con el MTT, en particular, también se benefician de la capacidad de las mediciones paralelas 5, 6 (estos no son alcanzados con la misma facilidad en FOMT dado el requisito de alineación de la correa de sujeción con respecto al centro del imán cilíndrico). Notablemente, MTT y FOMT no requieren, en contraste con otras técnicas, especialmente las nanopartículas manufacturadas de 22, 39, 40, diseño óptico complejo 41, o la introducción de cuentas adicionales dentro del atado (DNA) 42. Tal otécnicas ther pueden, no obstante, proporcionar otras ventajas, como una mayor resolución temporal de 27, 43, 44. Tanto FOMT y MTT deben encontrar futuras aplicaciones en el estudio de procesamiento de genoma, como el comportamiento de motores moleculares en el ADN es a la vez influenciado por y tiene consecuencias para el toque local y par motor. Las aplicaciones adicionales pueden ser encontrados en el campo emergente de la nanotecnología de ADN 27 o en el campo más amplio de motores giratorios activados en el procesamiento biológico 7, 45.
M270 (cordón de R = 1,4 m) | MyOne (cordón de R = 0,5 m) | Ademtech (cordón de R = 0,25 micras) | |
Convencional MT (par de cúbicos 5 x 5 x 5 mm 3 imanes, 1 mm de separación, alineación vertical) | 70 pN | 8 pN | 1.6 pN |
FOMT o MTT * (pila de tres imanes cilíndricos, 6 mm de diámetro, 2 brecha diámetro mm) | 9 pN | 1 pN | 0.2 pN |
FOMT o MTT * (pila de tres imanes cilíndricos, 6 mm de diámetro, 1 mm de distancia de diámetro) | 18 pN | 2 pN | 0.4 pN |
FOMT o MTT * (pila de tres imanes cilíndricos con último volteado, brecha 1 mm de diámetro) | ~ 50 pN | 9 pN | 1.8 pN |
* La presencia del imán lado pequeña en el MTT tiene un efecto insignificante en la fuerza de estiramiento
Tabla 1. Fuerzas máximas alcanzan típicamente para diferentes configuraciones de imán y tipos de cuentas.
R grano = 1,4 m | R grano = 0,5 m | R grano =0,25 m | |
Coeficiente de fricción * | 120 pN · nm · seg | 5,5 pN · nm · seg | 0,7 pN · nm · seg |
Escala de tiempo característica: FOMT, 10 kpb de ADN ** | 1200 seg | 55 seg | 7 seg |
Escala de tiempo característica: FOMT, ADN 1 kpb | 120 seg | 5.5 seg | 0,7 seg |
Escala de tiempo característica: MTT, k q = 100 pN · nm / rad | 1.2 seg | 0.06 seg | 0.007 sec |
Escala de tiempo característica: MTT, k q = 1,000 pN · nm / rad | 0.12 seg | 0,006 seg = 6 mseg | 0,0007 s = 0,7 ms |
* Coeficiente de fricción para la rotación alrededor de un eje a través de la "ecuador" (es decir, la situación mostrada en la Figura 1b), Dada por 14 · p · h · R talón 3, donde h es la viscosidad de la memoria intermedia.
** En el FOMT, la trampa rigidez rotacional está dada por la rigidez a la torsión del ADN, k q, ADN = C · k B T / L de C, donde C es la longitud de persistencia de torsión efectivo, supone que es 80 nm aquí ( que es característico de un régimen de fuerza intermedia, F ~ 1 Pn) y L C es la longitud de contorno de ADN, 0,34 nm por par de bases.
Tabla 2. Coeficientes de fricción y tiempo característico escalas para FOMT y MTT.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la Universidad Tecnológica de Delft, la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO), la Fundación para la Investigación Fundamental de la Materia, y por la Fundación Europea de la Ciencia.
Sandblaster | Great Lake Orthodontics | 190-070 Microetcher II | |
Nitrocellulose | Life Technologies | LC2001 | |
Magnetic particle concentrator | Life Technologies | 12002D | |
Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) | Polysciences | 17010 | |
Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) | Sanbio | PV05N/2179 | |
Antidigoxigenin | Roche | 11 214 667 001 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) | Ademtech | 3150 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) | Life Technologies | 650.01 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) | Life Technologies | 653.05 | |
Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) | Life Technologies | F-8768 | |
Cubic magnets for conventional tweezers | Supermagnete | W-05-N50-G | |
Cylindrical magnet for MTT and FOMT | Supermagnete | R-06-02-02G | |
Side magnet for MTT | Supermagnete | S-04-07-N | |
Linear stage | Physik Instrumente | M-126.PD | |
Rotary stage | Physik Instrumente | C-150 | |
High-resolution automated sample stage | Physik Instrumente | P-733.2D | |
Software for coding analysis routines | The Mathworks | Matlab | custom-written routines are available from the authors |