Магнитные пинцет, мощная техника манипуляции одной молекулы, могут быть адаптированы для прямых измерений твист (используя конфигурацию под названием свободно орбите магнитные пинцет) и крутящий момент (с помощью конфигурации называется, пинцет магнитного момента) в биологических макромолекул. Руководящие принципы для выполнения таких измерений приведены, в том числе приложений к изучению ДНК и связанных с ядерно-белковых нитей.
Методы одиночных молекул позволяют исследовать поведение отдельных биологических молекул в растворе в режиме реального времени. Эти методы включают так называемые силы спектроскопии подходы, такие как атомно-силовой микроскопии, оптические пинцеты, течь растяжения и магнитные пинцет. Среди этих подходов, магнитные пинцет отличились по их способности применять крутящий момент при сохранении постоянного растяжения силы. Здесь он показал, как такой "обычный" магнитные пинцет экспериментальная конфигурация может, через прямую модификации конфигурации поля, чтобы максимально уменьшить величину поперечного поля, быть адаптированы к измерить степень иронии в биологической молекулы. В результате конфигурация называется свободно-орбитальные магнитные пинцет. Кроме того, показано, как дальнейшую модификацию конфигурации поле может дать поперечное поле с величиной, промежуточным между & #8220; обычные "магнитные пинцет и свободно вращающиеся вокруг магнитных пинцет, что дает возможность непосредственно измерять крутящий момент хранится в биологической молекулы. Эта конфигурация называется магнитные пинцет крутящего момента. Сопровождающее видео подробно объясняет, как превращение обычных магнитных пинцетом в свободно-орбитальных магнитных пинцет и пинцетом магнитного крутящего момента может быть выполнена, и демонстрирует использование этих методов. Эти приспособления сохранить все сильные стороны обычных магнитных пинцетом в то время как значительно расширяет универсальность этого мощного инструмента.
В последние годы методы одиночных молекул доказали свою широкое применение при изучении белков поступательного двигателя и других ферментов, получая представление их кинетики и подстилающей механохимия. В контексте силовой спектроскопии, важный вклад сделана атомно-силовой микроскопии потока растяжения и оптических и магнитных пинцетом. Оптические и магнитные пинцет (MT) были особенно удалось объединить большую гибкость с точки зрения молекулярной манипуляции с высоким пространственным и временным разрешением. Здесь, мы ориентируемся на МТ, которые можно применить как растяжку усилия и моменты, чтобы биологических молекул привязаны между поверхностью и суперпарамагнитных бисером 1-3.
Магнитные пинцет (MT, Рисунок 1а) являются метод одной молекулы очень универсальный, который был использован для мониторинга как механические свойства нуклеиновых кислот, а также их взаимодействие с белками. МТ есть много силс, в том числе общего простоты и надежности экспериментальной реализации, легкому применения крутящего момента, природного эксплуатации и простой калибровки в режиме постоянного форс-4, расширение до параллельных измерений 5, 6, и отсутствие нагрева образца и фотостарения. По сравнению с другими одиночных молекул приближается, МТ предоставляют возможность проводить измерения силы-зависимость в силах, как низко как ≈ 10 дг и иметь возможность прямо контролировать степень сверхспирализации. В то время как МТС имеют преимущественно использовались в качестве экспериментального инструмента для исследования биологических процессов с участием нуклеиновых кислот 7, 8, они также нашли применение в исследованиях механических свойств белков 9-13 или клеток 10, 14-17. Многочисленные полезные ссылки доступны, которые описывают, как построить и запустить MT 4, 18-20.
Howevэ-э, обычные МТ не отслеживают вращательное движение непосредственно, и, в то время как они применяются крутящий момент, они не измеряют крутящий момент непосредственно. Кроме того, они ограничивают свободное вращение троса нуклеиновой кислоты. Здесь мы представляем два расширения магнита пинцетом. Первые, называемые свободно вращающиеся вокруг магнитных пинцет (FOMT, 1б) 21, позволяет измерения колебаний угловых равновесия и изменений в иронии привязных молекул нуклеиновых кислот, без ограничения вращательное движение вокруг оси троса. Второй, названный магнитные пинцет крутящего момента (МТТ, Рисунок 1в), который имеет возможность применять и непосредственно измерить как усилия и моменты одиноким биомолекул 22-27.
В следующем протоколе, мы предполагаем, что читатель имеет на его / ее распоряжении "обычных" МТ приборов. Мы отсылаем читателя к дискуссии для справок о том, как построить и запустить MT настроить, а также Рассмотритерационы, которые должны быть приняты во внимание при выборе магнитных шариков, магниты, и процедур отслеживания. Кроме того, разделы 1 и 2 Протокола Текст описать, как мы обычно подготовить и инкубировать образец ДНК для использования в МТ, а также предварительные измерения, которые могут выполняться на одном ДНК в обычном MT. Разделы 3 и 4 Протокола Текст иллюстрируют, как инструмент МТ могут быть легко адаптированы и использованы для FOMT и МТТ измерений.
При проведении экспериментов с использованием МТТ или FOMT, несколько вариантов должны быть сделаны в отношении бисером, магнитов, сопровождение протоколами и т.д. Лучшие выбор должен быть сделан, будет зависеть от эксперимента интересов. Ниже мы опишем компромиссов, которые сопровождают различные варианты, которые должны облегчить выбор для конкретного эксперимента. Далее мы опишем несколько важных шагов, которые сопровождают выравнивание и ход МТТ и FOMT экспериментов. Наконец, мы обсуждаем значимость МТТ и FOMT относительно существующих методов, а также будущих приложений.
Соображения перед началом МТТ и FOMT экспериментов
Любой эксперимент требует, чтобы выбрать тип магнитного валика для использования. Можно выбрать между несколькими коммерчески доступных покрытых стрептавидином суперпарамагнитные шарики, например, 0,25 мкм радиус бусы, 0,5 мкм радиус бисером, или 1,4 мкм радиус бисера (ыи ее таблицу материалы). Большие шарики будут иметь повышенный магнитный момент по сравнению с небольших шариков (примерно масштабирования как объем) и, следовательно, их использование будет способствовать применение высших сил (для типичных сил, достигнутых в наших инструментов, см. таблицу 1). Когда угловая отслеживания с помощью маркеров шарики желательно, мы, как правило, работают с радиусом 1.4 мкм и использовать 0,5 радиуса мкм немагнитных биотинилированных бусы как маркерных шариков (см. пункт 1.9 для соответствующего протокола крепления). Использование небольших шариков особенно рекомендуется для FOMT, в качестве характерного сроки для вращения шарика τ C равна отношению сопротивления системы над своей весенней постоянной γ / к θ; главное, вращения, коэффициент аэродинамического сопротивления отношение к угловых время измерения масштабных шкал как ~ R шарик 3, то есть с третьей степени радиуса (см. таблицу 2 дляхарактерное время весы для нескольких комбинаций шарик-ДНК в FOMT и измерений МТТ). Сопровождающие снижение максимальной силы, которые могут применяться могут быть решены с помощью перевернуть стопку цилиндрических магнитов 27. Тем не менее, в измерениях FOMT иногда может быть необходимо идти на компромисс между лучшей достижимой временным разрешением и максимальной приложенной силы.
Кроме того, эксперимент требует выбора конфигурации магнита. В обычном магнитные пинцетом конфигурации (рис. 1а), мы обычно используем пару 5x5x5 мм кубических магнитов в вертикальной ориентации с 0,5 или 1 мм зазора между магнитами 4. Когда магниты расположены вдоль х (у) оси, это дает магнитное поле, которое, в первую очередь, направленную вдоль х (у) оси. Для FOMT экспериментов, цилиндрической формы магнита выбирается в центре которого магнитное поле в основном направленнойвдоль оси (рис. 1b). На практике мы используем стек из трех таких цилиндрической формы магнитов, каждый с диаметром 6 мм и центральным отверстием диаметром 2 мм, для общей толщиной 6 мм. Когда более высокие силы растяжения желательно, предпочтительным является "щелкнул стек" конфигурация магнит, в котором нижний магнит сгруппирован с противоположной намагниченностью. Для достижения конфигурацию МТТ (фиг. 1C), мы добавить дополнительный магнит на стороне основного магнита стопку конфигурации FOMT, обычно твердого цилиндра с диаметром 4 мм и высотой 7 мм. Чтобы увидеть, как максимальные силы, достигнутые в наших инструментов зависит от конфигурации магнитного, см. таблицу 1.
Выравнивание МТТ и FOMT экспериментов
Поскольку магнитные шарики имеют (приблизительно) равномерно функционализованный поверхность (обычно стрептавидином) и с приложением как функционализованного ппривязи ucleic кислоты и маркерные шарики (в случае используется маркер шарик на основе углового слежения) происходит через простой инкубации в растворе, не контролировать, где троса и / или маркер шарик приложить к магнитному шарик. Магнитные шарики имеют предпочтительную ось намагниченности, который имеет тенденцию выравнивать вдоль направления внешнего поля. Если обозначить точки, где предпочтительным оси намагничивания пересекает поверхность борта в качестве северного и южного полюсов, то бусы, где ДНК-троса крепится близко к экватору будет проследить кругового кольца с радиусом близко к или немного больше, чем радиус шарика в FOMT; в отличие, бусы, которые прикреплены близко к южному полюсу будет колебаться на круговом кольце с очень маленьким радиусом в FOMT, которые могут препятствовать установка круга с помощью уравнений 3-5. Отметим, что путем простого сферической геометрии, вероятность присоединения вблизи экватора гораздо больше, чем вложения именно на полюсах; Поэтому, наиболее бEADS будет привязан так, что (х, у) на основе углового слежения может быть осуществлена успешно.
Аналогичное рассуждение справедливо и для прикрепления маркерных шариков для доверительной маркера на основе углового слежения. Маркер шарик используется для создания асимметрии в изображении магнитного шарика, который позволяет отслеживать угол. Если маркер шарик крепится точно в северо или южного полюса шарик (то есть непосредственно на вершине или на дне), полученное изображение по-прежнему осесимметричной и протокол угловая отслеживания не удается. Тем не менее, одним и тем же сферической аргумента геометрии, шанс на маркер шарик приложить непосредственно на одном из полюсов относительно невелика; мы находим, что на практике большинство маркеров шарики дают достаточное асимметрию, чтобы включить углового слежения. Наконец, отметим, что в обычных магнитных пинцетом направление поля в плоскости (х, у) плоскости; Поэтому, предпочтительные оси намагничивания борта будет согласовывать в гое (х, у)-плоскость и Северный и Южный полюсы, как указано выше, будут по бокам борта, вряд ситуация в FOMT или МТТ, где поляки в верхней и нижней части.
В FOMT экспериментов, важным шагом является выравнивание цилиндрического магнита таким образом, что радиальное магнитное поле незначительна в непосредственной близости от борта. Данное выравнивание выполняется для одного борта одновременно. Чтобы судить о том, движение шарика в FOMT равномерно распределяется по круговом кольце, время измерения должна превышать 20 · τ C. Как τ C равна ~ 45 сек для 8 кб ДНК и радиусом 0,5 мм шарик, время измерения составляет ~ 900 сек в завершающей стадии согласования. Для сравнения, использование 1,9 кб ДНК и 0,25 мм радиус шариков уменьшает τ С двадцать раз до ~ 2 сек (см. также таблицу 2).
Критические шаги и основные аспекты скольжение на FOMT и MTT Эксперименты
Для отслеживания шарик находится в плоскости колебаний, то есть его (х, у)-положении, мы используем кросс-корреляционный анализ профилей интенсивности отображаемых шарик на последующих интервалах времени 35, 36. Это может осуществляться с разрешением подпиксельной с точностью до нескольких нанометров 20. Чтобы отслеживать движение шарик в в г, мы обычно используем метод в первую разработан Gosse и крокеты, в котором в фокальной плоскости Цель автора (ОФП) точно смещается в вертикальном направлении в то время визуализации дифракционные кольца борта, прикрепленной к нуклеиновой кислоты 20 . Таким образом, профиль калибровки генерируется корреляции дифрактограмма борта с расстоянием между буртиком и ОФП 19. Когда эта калибровка профиль изучен, вертикальные смещения борта могут быть измерены с точностью до нескольких нм 20.Мы отсылаем читателя к дополнительных ссылок, которые описывают более изощренные алгоритмы отслеживания 37, 38, а также их применение в параллельные отслеживание нескольких шариков 5, 6, 37.
При использовании углового слежения, которая опирается на преобразовании (х, у)-позиций в угловых координат, советуем поступить следующим образом. От времени следа, в котором шарик вычерчивает кругового кольца, использовать (х я, у я) позиции (где индекс я обозначает последующие точки измерения), чтобы соответствовать центр окружности (х 0, у 0) и радиусом R круг (рис. 2а), минимизируя:
(3)
где сумма берется по всем точкам данных. После Fittiнг х 0, у 0, и R круг, определить полярные координаты (г я, θ I) из каждой точки данных во временном следа с помощью:
(4)
(5)
Обратите внимание, что следует заботиться, чтобы "развернуть" угол θ, т.е. добавить фазовые скачки ± π в случае необходимости. Заказ написанный код для установки и перехода от (х, у) в (г, θ) координирует доступен у авторов по запросу. В FOMT, время след, в котором шарик вычерчивает кругового кольца могут быть получены путем достижения грубую выравнивание (см. шаг 3.3) и записи тепловые флуктуации борта. В МТТ, тепловой флуктуацииобъема недостаточно проследить круговое кольцо; Вместо этого используйте времени след где магниты медленно (как правило, на 0,1 Гц) поворачивается на несколько оборотов, чтобы соответствовать круг с помощью уравнений 3-5.
Отметим, что для МТТ, важно правильно выбрать угловую отслеживания подход, то есть через угловое отслеживания маркера (рис. 1в, 1г рис, рис 3а) или через преобразования (х, у)-позиций в угловых координат ( Рисунок 1г, 2б). В то время как обычно в точности углового слежения от (х, у)-позиций и использования маркеров бисером сопоставимы, важно понимать, что перекрестные помехи происходит между колебаниями шарик в в (х, у) и в угол, как описано в Янссен и др. 32: так, угловая слежения от (х, у)-положениях действует только при условии, что броуновские колебания (х, У) вклад незначительно с неопределенностью в угловой координаты, и его правильное использование (х, у)-слежения может потребовать настройку вращения ловушки жесткости через настройки положения боковой магнита. Как правило, использование более высокой жесткости ловушки требует использования углового слежения с помощью маркера шариков. Использование маркеров бисером требует дополнительной стадии привязанности, что может уменьшить количество используемых тросов (см. протокол вложений на этапе 1.9). При использовании отслеживания шарик на основе маркеров, важно, чтобы выбрать магнитных шариков, которые имеют маркер шарик прикреплен вблизи экватора для достижения наилучших результатов.
Значимость FOMT и МТТ Подходы По сравнению с существующими методами и приложений
Выше мы показали, как можно, начиная от обычного MT, легко изменить конфигурации магнитных преобразовать инструмент в МТТ или FOMT. Это просто мodification, которая может сопровождаться введением углового слежения, когда использование угловой отслеживания маркера желательно, является непосредственным сильной стороной обеих конфигурациях, так как позволяет пользователю применять крутящий момент, измерения крутящего момента, или измерить поворот в зависимости от экспериментировать под рукой. Как уже упоминалось во введении, как FOMT и МТТ выгоды от многих существующих сильных сторон МТ, в частности их простоте, с МТТ в частности, также пользуются возможностью параллельных измерений 5, 6 (они не так легко добиться в FOMT дано требование выравнивания троса по отношению к центру цилиндрического магнита). Примечательно, что МТТ и FOMT не требуют, в отличие от других методов, специально нано-сфабрикованы частиц 22, 39, 40, сложной оптической конструкции 41 или введения дополнительных шариков в привязи (ДНК) молекулы 42. Такое оTher методы могут, тем не менее обеспечить другие преимущества, такие как более высоким временным разрешением 27, 43, 44. Оба FOMT и МТТ следует найти будущих приложений в изучении обработки генома, как поведение молекулярных моторов на ДНК является и влияние и имеет последствия для местного твист и крутящего момента. Дополнительные приложения можно найти в новой области нанотехнологии ДНК 27 или в более широкой области роторных двигателей, работающих в биологической обработки 7, 45.
M270 (R шарик = 1,4 мкм) | MyOne (R шарик = 0,5 мкм) | Ademtech (R шарик = 0,25 мкм) | |
Обычные MT (пара кубических 5 х 5 х 5 мм 3 магнитов, 1 мм зазор, вертикальное выравнивание) | 70 пН | 8 Ру | 1.6 пН |
FOMT или МТТ * (стек из трех цилиндрических магнитов, диаметр 6 мм, 2 мм зазор диаметр) | 9 пН | 1 пН | 0,2 пН |
FOMT или МТТ * (стек из трех цилиндрических магнитов, диаметр 6 мм, 1 мм зазор диаметр) | 18 пН | 2 PN | 0,4 пН |
FOMT или МТТ * (стек из трех цилиндрических магнитов с последнего перевернул, 1 мм зазор диаметр) | ~ 50 PN | 9 пН | 1.8 пН |
* Наличие небольшой боковой магнита в МТТ оказывает незначительное влияние на силы растяжения
Таблица 1. Максимальные усилия обычно достигается для различных конфигураций магнитных и типов бортовых.
R шарик = 1,4 мкм | R шарик = 0,5 мкм | R шарик =0,25 мкм | |
Коэффициент трения * | 120 пН · нм · сек | 5.5 пН · нм · сек | 0,7 пН · нм · сек |
Характерное время шкала: FOMT, 10 кб ДНК ** | 1200 сек | 55 сек | 7 сек |
Характерный временной масштаб: FOMT, 1 кб ДНК | 120 сек | 5.5 сек | 0,7 сек |
Характерный временной масштаб: МТТ, к д = 100 PN · Нм / рад | 1.2 сек | 0.06 сек | 0,007 сек |
Характерный временной масштаб: МТТ, K Q = 1000 пН · Нм / рад | 0.12 сек | 0.006 сек = 6 мс | 0.0007 сек = 0,7 мс |
* Коэффициент трения с возможностью вращения вокруг оси, проходящей через "экватор" (то есть ситуации, показанной на рисунке 1b), Задается 14 · р · ч · R шарик 3, где А представляет собой вязкость буфера.
** В FOMT, вращательное ловушка жесткость дается жесткости на кручение ДНК, K Q, ДНК = С · К В T / L, где С является эффективным при кручении длина настойчивость, предполагается, что 80 нм здесь ( что характерно для промежуточной силы режима, F ~ 1 рп) и L C является контурная длина ДНК, 0,34 нм на пары оснований.
Коэффициенты Таблица 2. Фрикционные и характерное время весы для FOMT и МТТ.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана TU Delft, Нидерландской организации научных исследований (NWO), Фонда фундаментальных исследований по Материи, и Европейским научным фондом.
Sandblaster | Great Lake Orthodontics | 190-070 Microetcher II | |
Nitrocellulose | Life Technologies | LC2001 | |
Magnetic particle concentrator | Life Technologies | 12002D | |
Non-magnetic latex beads (0.5 μm radius) | Polysciences | 17010 | |
Non-magnetic latex beads (1.5 μm radius) | Sanbio | PV05N/2179 | |
Antidigoxigenin | Roche | 11 214 667 001 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.25 μm radius) | Ademtech | 3150 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (0.5 μm radius, “MyOne”) | Life Technologies | 650.01 | |
Streptavidin-coated superparamagnetic beads (1.4 μm radius, “M270”) | Life Technologies | 653.05 | |
Biotin-coated latex beads (0.5 μm radius) | Life Technologies | F-8768 | |
Cubic magnets for conventional tweezers | Supermagnete | W-05-N50-G | |
Cylindrical magnet for MTT and FOMT | Supermagnete | R-06-02-02G | |
Side magnet for MTT | Supermagnete | S-04-07-N | |
Linear stage | Physik Instrumente | M-126.PD | |
Rotary stage | Physik Instrumente | C-150 | |
High-resolution automated sample stage | Physik Instrumente | P-733.2D | |
Software for coding analysis routines | The Mathworks | Matlab | custom-written routines are available from the authors |