Nanomanipolazione di Single RNA Molecole da pinzette ottiche

Summary

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Abstract

Una gran parte del genoma umano viene trascritto ma non tradotto. In questo post genomica, funzioni di regolamentazione di RNA hanno dimostrato di essere sempre più importante. Dato che la funzione RNA spesso dipende dalla sua capacità di adottare strutture alternative, è difficile prevedere RNA strutture tridimensionali direttamente dalla sequenza. Singola molecola approcci mostrano potenzialità per risolvere il problema di RNA polimorfismo strutturale monitorando strutture molecolari una molecola alla volta. Questo lavoro presenta un metodo per manipolare con precisione la piegatura e la struttura delle molecole di RNA singoli utilizzando pinzette ottiche. In primo luogo, i metodi per sintetizzare molecole adatte a singola molecola lavoro meccanico sono descritti. Avanti, diverse procedure di calibrazione per garantire le operazioni corrette delle pinzette ottiche sono discussi. Successivamente, vari esperimenti sono spiegati. Per dimostrare l'utilità della tecnica, i risultati di dispiegamento meccanicamente forcine RNA e un singolo RNA kissing complesso sono utilizzati come prova. In questi esempi, la tecnica nanomanipolazione stato utilizzato per studiare piegatura di ciascun dominio strutturale, comprese secondaria e terziaria, in modo indipendente. Infine, le limitazioni e le future applicazioni del metodo sono discussi.

Introduction

Lo sviluppo della tecnica pinzette ottiche è stata a lungo accompagnato con la sua applicazione nella ricerca biologica. Quando l'effetto intrappolamento ottico è stato scoperto, Arthur Ashkin osservato che i batteri in acqua contaminata potrebbero essere intrappolati nel fuoco del laser ^1. Da allora, i batteri trapping è diventato un involontario, divertente esperimento per generazioni di studenti biofisica, nonché come strumento di ricerca seria per studiare la fisiologia microbica ^2,3. La tecnica di intrappolamento ottico utilizza focalizzato fascio laser per immobilizzare un oggetto microscopico ^1. In pratica, una funzione di limitatore laser come una molla ottico, che misura anche la forza (F) sull'oggetto intrappolato dal suo spostamento dal centro della trappola (AX). Entro un breve intervallo, F = κ x AX, in κ è la costante della molla della trappola. La trappola ottica può essere utilizzato per esercitare una forza in piconewton (PN) di precisione ad un microsoggetto Copic e misurare la sua posizione con nanometri (nm) di precisione. Negli ultimi due decenni, pinzette ottiche sono diventati una delle più utilizzate tecniche di singola molecola in biofisica. La tecnica è stata impiegata per studiare piegatura e la meccanica di ^4-6 DNA, RNA ^7-9, e le proteine ^​​10,11. Pinzette ottiche sono stati utilizzati anche per osservare la replicazione del DNA ^12, trascrizione dell'RNA ^13, e la sintesi proteica ^14,15, così come molti altri eventi biomolecolari ^16-18.

Approcci singola molecola sono impiegati in RNA ricerca strutturale principalmente per esplorare il paesaggio aspro energia folding di RNA. Una sequenza di RNA di solito può piegare in più stabili, strutture si escludono a vicenda, a causa delle semplici di composizione chimica e di sbucciatura base di regole di RNA. E 'noto da tempo che l'RNA polimorfismo strutturale, come ad esempio che si verifica in riboswitches ^19,20, gioca un ruolo importante nella regolazione genica. A Recent sondaggio a livello di genoma ha rivelato che le variazioni di temperatura di soli pochi gradi influenzano notevolmente la struttura e la sintesi proteica di una grande porzione del trascrittoma cellulare ^21. Questo esempio suggerisce che il ruolo biologico di RNA folding alternativa è forse più importante e pervasivo di quanto precedentemente ipotizzato. Polimorfismo strutturale, tuttavia, rappresenta una sfida per i tradizionali approcci biochimici e biofisici, che esaminano le proprietà medie di molte molecole. Ad esempio, la "a" e conformazioni "off" di un riboswitch si escludono a vicenda. Una struttura media derivato da strutture eterogenee non è in grado di assomigliare uno dei conformeri biologicamente rilevanti. Inoltre, RNA non tradotta e mRNA di solito formano strutture. La loro interazione con proteine ​​e RNA regolatori comunemente richiede svolgersi della struttura esistente come parte dell'interazione. Pertanto, lo studio di RNA dispiegamento / ripiegamento diventa un pertinentequestione di RNA biologia. Per rispondere a tale sfida, l'approccio di singola molecola è stato impiegato per svelare RNA polimorfismo strutturale studiando una molecola alla volta ^22-27.

Rispetto al popolare metodo di fluorescenza singola molecola, pinzette a base meccanica dispiegarsi offre un vantaggio che conformazioni delle singole molecole possono essere manipolati con la forza applicata e essere misurate con precisione nanometrica. Questa capacità nanomanipolazione può essere utilizzato per monitorare il dispiegamento / ripiegamento dei singoli domini strutturali tali che la piegatura gerarchica di un grande RNA può essere sezionato ^28. In alternativa, un singolo filo può essere diretto a piegare in uno dei diversi conformeri; o una struttura esistente può essere indotta meccanicamente per ripiegare in una diversa conformazione ^29. In condizioni biologiche, una struttura di RNA può essere modificato in caso di cambio di temperatura o ligando. La capacità di manipolare direttamente s molecolariTRUTTURA apre una nuova sede di RNA studio strutturale. In linea di principio, altre tecniche meccaniche come microscopio a forza atomica e pinzette magnetiche, possono anche essere utilizzati per studiare piegatura di singole molecole di RNA. Tuttavia, tali applicazioni sono limitate soprattutto a causa della risoluzione spaziale relativamente bassa ^30.

L'impiego di pinzette ottiche permette strutture di RNA di essere spiegati con la forza meccanica.

Il vantaggio di meccanica svolgimento è diverse volte. La forza può essere usata per spiegare sia le strutture secondarie e terziarie, mentre gli ioni metallici e ligando indotta piegatura sono limitati principalmente a strutture terziarie. Temperatura e denaturante possono influenzare in modo significativo le attività di acqua e soluti. Al contrario, la forza viene applicata localmente per perturbare strutture molecolari; l'effetto della forza sull'ambiente circostante è trascurabile. Inoltre, la fusione termica è meglio utilizzato per studiare la termodinamica pieghevoli di piccole strutture di RNA,considerando pinzette ottiche sono stati utilizzati per studiare le strutture di RNA con diverse dimensioni, che vanno da un sette-base-pair tetraloop tornante ²⁸ per un ribozyme 400-nucleotide ^31. Inoltre, le strutture di RNA possono essere spiegati meccanicamente a temperature mesofili. In contrasto, di dispiegarsi RNA in un esperimento di fusione termica, la temperatura è in genere ben sollevato sopra temperature fisiologiche, che aumenta significativamente l'RNA all'idrolisi, soprattutto in presenza di ioni Mg ^{2 +.}

È importante notare che l'effetto meccanico della forza dipende da come viene applicato ad una struttura. La forza applicata inclina il pieghevole panorama energetico. Ad esempio, quando la forza è applicata ad una forcina, le coppie di basi sono rotti in sequenza, uno alla volta (Figura 1a). La forcella strappo avanza lungo l'asse elicoidale, che è perpendicolare alla forza applicata. Al contrario, quando un complesso baciare minima è sotto tensione, i due baciandocoppie di basi, che sono parallele alla forza applicata, condividono il carico di forza (Figura 1b). Le diverse geometrie del tornante e baciare relativo complesso al risultato forza applicata nella loro risposta meccanica differente, che può essere utilizzata per distinguere secondaria e terziaria piegatura ^28,32. L'aspetto teorico della meccanica svolgimento è stato già recensito ^8,9,30. Questo lavoro descrive gli approcci di base per impostare ed eseguire una singola molecola meccanico test dispiegarsi.

Setup sperimentale. Nel nostro esperimento trazione meccanica, il campione di RNA per tweezing è costituito da RNA di interesse affiancato da due manici a doppio filamento di DNA / RNA (Figura 2) ^7. L'intera molecola può essere legato a due perle di micron-size superficie rivestita (Spherotech) tramite streptavidina-biotina e interazioni anticorpi anti-digossigenina-digoxigenin rispettivamente. Una perla è detenuto da un tr ottica forza di misuraap, mentre l'altra si tiene sulla punta di una micropipetta. La distanza relativa tra le perline può essere cambiato da uno sterzo trappola o spostando la micropipetta. Usando questo approccio, una singola molecola di RNA legare le perline può essere allungato e rilassato.

Preparazione dei campioni. La sintesi di campioni di RNA per tweezing comprende a pochi passi (Figura 3). Innanzitutto, la sequenza di DNA corrispondente alla RNA di interesse viene dapprima clonato in un vettore plasmidico. Avanti, tre reazioni di PCR vengono eseguite per generare le due maniglie e un modello per la trascrizione. Il modello trascrizione comprende le regioni della leva e le sequenze inserite. La lunghezza totale RNA è sintetizzato in vitro trascrizione. Infine, l'RNA e le maniglie modificati chimicamente sono sottoposti a ricottura insieme per generare le molecole per tweezing.

Taratura e funzionamento delle pinzette. Il disegno di base dell'uso Minitweezersd in questo lavoro segue quello dei dual-beam pinzette ottiche ^33. Con molti miglioramenti, i Minitweezers visualizzare straordinaria stabilità rispetto alle pinzette ottiche di prima generazione. Un certo numero di gruppi di ricerca in diversi paesi utilizzano le Minitweezers nella loro ricerca singola molecola ^14,15,34-37. I dettagli di costruzione, taratura e il funzionamento del dispositivo, inclusi video di istruzioni, sono disponibili sul sito "Pinzetta Lab" (http://tweezerslab.unipr.it). Qui, miglioramenti e procedure di calibrazione che devono essere eseguite su basi giornaliere sono descritte in dettaglio.

Protocol

1 Preparazione di RNA Molecole per singola molecola Togliersi Clonazione la sequenza di interesse. Clonare la sequenza di DNA corrispondente alla struttura di RNA in un vettore. Sintesi e purificazione del template trascrizione. Sintetizzare un modello di trascrizione mediante PCR. [Tabella 1 posto qui] Avanti, purificare i prodotti di PCR utilizzando un kit di purificazione PCR, e concentrare il campione> 200 ng / ml. Poiché il DNA purificato viene utilizzato per la trascrizione, RNasi acqua li…

Representative Results

Limitato dallo spazio, nanomanipolazione di singole molecole di RNA è dimostrato mostrando solo esempi meccanici dispiegarsi di forcine RNA e di un RNA con struttura terziaria. Manipolare singolo Hairpin Molecole Una volta che una pastoia è stabilito tra le perle, l'estensione di e vigore alla cavezza possono essere manipolati tramite un protocollo definito dall'utente. Quattro protocolli comuni di manipolazione sono comunemente usati. …

Discussion

Modifica e risoluzione dei problemi in preparazione di campioni tweezing

Scelta di clonazione vettoriale. Sebbene lo schema generale qui descritto (Figura 3) non richiede una speciale clonazione vettore, il vettore è preferito non avere T7 intrinseca o promotore T3 per la facilità di trascrizione tale che un promotore può essere introdotto tramite PCR in posizioni desiderate.

Sequenza e Lunghezze delle manig…

Materials

Minitweezers	Steven B. Smith Engineering		http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card	National Instruments	USB-6351
Video card	National Instruments	PCI-1407
Labview programming software	National Instruments
NI Vision Builder	National Instruments
Laser engraver	Epilogue laser systems	Zing-16
PCR purification kit	Qiagen	28104
MEGAscript T7 kit	Life Technologies	AM1334
MEGAclear kit	Life Technologies	AM1908
Biotin-11-UTP	Thermo Fisher	FERR0081
T4 DNA polymerase	New England Labs	M0203
Streptavidin coated microsphere	Spherotech	SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere	Spherotech	DIGP-20-2
Size standard microspheres	Spherotech	PPS-6K
Kapton tape	Kaptontape.com	KPPTDE-1
No. 2 cover glass	Thermo Fisher	12-543D