Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.
Uma grande parte do genoma humano é transcrito, mas não traduzidos. Neste pós genómico, as funções reguladoras de RNA foram mostrados para ser cada vez mais importante. Como função de ARN, muitas vezes depende da sua capacidade para adoptar estruturas alternativas, isto é difícil de prever a estrutura tridimensional de ARN directamente a partir da sequência. Uma única molécula de abordagens apresentam potenciais para resolver o problema de polimorfismo de ARN através da monitorização de estruturas moleculares de uma molécula de cada vez. Este trabalho apresenta um método para manipular com precisão o dobramento e estrutura de moléculas de RNA utilizando pinças ópticas. Primeiro, os métodos para sintetizar moléculas adequadas para o trabalho mecânico única molécula são descritos. A seguir, vários procedimentos de calibração para garantir as operações próprias dos pinças ópticas são discutidos. Em seguida, vários experimentos são explicados. Para demonstrar a utilidade da técnica, os resultados de desdobramento mecanicamente grampos de ARN e um único RNA Kissing complexo são usados como prova. Nestes exemplos, a técnica nanomanipulação foi utilizado para estudar dobragem de cada domínio estrutural, incluindo secundário e terciário, de forma independente. Por fim, são discutidas as limitações e as futuras aplicações do método.
O desenvolvimento da técnica de pinças ópticas tem sido acompanhada com a sua aplicação no domínio da investigação biológica. Quando o efeito de captura óptica foi descoberto pela primeira vez, Arthur Ashkin observado que as bactérias em água contaminada pode ser preso no foco do laser 1. Desde então, as bactérias trapping tornou-se um involuntário, experiência divertida para gerações de estudantes de biofísica, bem como uma ferramenta de pesquisa séria para estudar a fisiologia microbiana 2,3. A técnica de captura óptica usa raio laser focado para imobilizar um objeto microscópico 1. Na prática, uma série de funções de armadilha de laser como uma fonte óptica, que também mede a força (F) sobre o objecto preso pelo seu deslocamento a partir do centro da armadilha (AX). Dentro de um curto intervalo, F = κ x AX, em κ é a constante da mola de prender. A armadilha óptica pode ser utilizado para exercer uma força em piconewton (pN) de precisão para uma microscopic objeto e medir a sua posição com nanômetros (nm) de precisão. Nas últimas duas décadas, pinças ópticas tornaram-se uma das técnicas de moléculas individuais mais utilizados em biofísica. A técnica tem sido utilizada para estudar e dobragem mecânica de ADN de 4-6, 7-9 de ARN, e proteínas de 10,11. As pinças ópticas também têm sido utilizados para observar a replicação de DNA de 12, a transcrição do RNA 13, e a síntese de proteínas 14,15, bem como muitos outros eventos biomoleculares 16-18.
Abordagens de moléculas individuais são empregadas na pesquisa estrutural RNA principalmente para explorar a paisagem de energia dobrável robusto de RNA. Uma seqüência de RNA geralmente pode dobrar em várias estruturas, que se excluem mutuamente estáveis, devido às regras de composição química e desbastes de base simples de RNA. Tem sido conhecido que o polimorfismo de ARN, como a que ocorre em riboswitches 19,20, desempenha um papel importante na regulação de genes. A recent levantamento de todo o genoma revelou que as variações de temperatura tão pequenas como alguns graus influenciar grandemente a estrutura e síntese de proteínas de grande parte do transcriptoma celular 21. Este exemplo sugere que o papel biológico de alternativa dobrar RNA é talvez mais importante e abrangente do que o suposto anteriormente. Polimorfismo estrutural, no entanto, representa um desafio para as abordagens tradicionais bioquímicos e biofísicos, que examinam as propriedades médias de muitas moléculas. Por exemplo, o "on" e conformações "off" de uma riboswitch são mutuamente exclusivas. Uma estrutura média derivada de estruturas heterogéneas não é provável que se assemelham a um dos confórmeros biologicamente relevantes. Além disso, o ARN não traduzida do mRNA e geralmente formar estruturas. Sua interação com proteínas e RNAs regulatórios comumente requer desdobramento da estrutura existente, como parte da interação. Portanto, estudar RNA desdobramento / redobramento se torna um pertinenteemissão de biologia ARN. Para atender a este desafio, foi empregue uma abordagem única molécula de ARN de desvendar polimorfismo estudando uma molécula de cada vez 22-27.
Em comparação com o método popular de fluorescência única molécula, com base pinça mecânica desdobramento oferece uma vantagem que as conformações das moléculas individuais podem ser manipulados pela força aplicada e ser medido com uma precisão nanométrica. Esta capacidade nanomanipulação pode ser utilizado para monitorar o desdobramento / dobragem de domínios estruturais individuais de tal modo que a dobragem hierárquica de um grande de RNA podem ser dissecados 28. Alternativamente, um único filamento pode ser dirigido a dobrar-se em um dos diversos confórmeros; ou uma estrutura existente pode ser induzida mecanicamente para redobrar a uma conformação diferente 29. Sob condições biológicas, uma estrutura de ARN podem ser alterados em caso de alteração da temperatura ou a ligação do ligando. A capacidade de manipular diretamente s molecularestructure abre um novo espaço de estudo estrutural RNA. Em princípio, outras técnicas mecânicas, tais como microscopia de força atómica e pinças magnéticas, também podem ser usadas para estudar dobra de moléculas de ARN individuais. No entanto, essas aplicações são limitadas em grande parte devido à relativamente baixa resolução espacial de 30.
O emprego de pinças ópticas permite que estruturas de RNA a ser desdobrada pela força mecânica.
A vantagem mecânica desdobramento é várias vezes. Força pode ser usado para desdobrar as estruturas tanto secundárias e terciárias, enquanto íons de metal e ligante induzida dobrável são principalmente limitado a estruturas terciárias. Temperatura e desnaturante pode afetar significativamente as atividades de água e solutos. Em contraste, a força é aplicada localmente para perturbar as estruturas moleculares; o efeito da força sobre o meio ambiente é insignificante. Além disso, a fusão térmica é melhor usado para estudar termodinâmica dobragem de pequenas estruturas de ARN,Considerando que as pinças ópticas têm sido utilizadas para o estudo das estruturas de ARN com vários tamanhos, que vão desde um de sete pares de bases tetraloop grampo 28 para um ribozima 400 nucleótidos 31. Além disso, as estruturas de ARN pode ser desdobrada mecanicamente a temperaturas mesófilas. Em contraste, os ARN de se desdobrar em uma experiência de fusão térmica, a temperatura é normalmente levantada bem acima das temperaturas fisiológicas, o que aumenta significativamente a hidrólise de ARN, especialmente na presença de iões Mg2 +.
É importante notar que o efeito da força mecânica depende de como ele é aplicado a uma estrutura. A força aplicada inclina o panorama energético dobrar. Por exemplo, quando a força é aplicada a um gancho de cabelo, as pares de bases são sequencialmente quebrada, um de cada vez (Figura 1-A). O garfo rasgando progride ao longo do eixo helicoidal, que é perpendicular à força aplicada. Em contraste, quando um complexo de beijos mínima está sob tensão, os dois kissingpares de bases, que são paralelas à força aplicada, partilhar a carga de força (Figura 1b). As diferentes geometrias do gancho e kissing relativamente complexo para o resultado a força aplicada na sua resposta mecânica diferentes, que podem ser utilizados para distinguir dobragem secundário e terciário 28,32. O aspecto teórico da mecânica desdobramento foi previamente analisado 8,9,30. Este trabalho descreve as abordagens básicas para configurar e executar uma única molécula de ensaio desdobramento mecânico.
Configuração Experimental. Na nossa experiência, puxando mecânica, a amostra de ARN para pinça consiste no ARN de interesse ladeado por duas pegas de ADN / ARN de cadeia dupla (Figura 2) 7. Toda a molécula pode ser amarrado a dois micro-grânulos revestidos de tamanho de superfície (SPHEROTECH) através de estreptavidina-biotina e as interacções de anticorpos anti-digoxigenina-digoxigenina, respectivamente. Um cordão é realizada por um tr óptico de medição de forçaap, enquanto que a outra é mantida na ponta de uma micropipeta. A distância relativa entre os grânulos pode ser alterada por dirigir o movimento da armação ou da micropipeta. Usando esta abordagem, uma única molécula de ARN de amarrar os grânulos pode ser esticado e relaxado.
Preparação de Amostras. A síntese das amostras de ARN para pinça inclui alguns passos (Figura 3). Em primeiro lugar, a sequência de DNA correspondente ao RNA de interesse é clonado em primeiro lugar num vector de plasmídeo. Em seguida, três reacções de PCR são realizadas para gerar as duas alças e um molde para a transcrição. O modelo de transcrição engloba as regiões do puxador e as sequências inseridas. O ARN completo é sintetizado por transcrição in vitro. Por último, o ARN e alças quimicamente modificados são hibridados em conjunto para gerar as moléculas de pinça.
Calibração e Operação de pinças. O projeto básico do uso Minitweezersd neste trabalho segue a dos dual-feixe de pinças ópticas 33. Com muitos melhoramentos, os Minitweezers exibir extraordinária estabilidade, em comparação com as pinças ópticas da primeira geração. Um certo número de grupos de pesquisa em vários países usam os Minitweezers em sua pesquisa uma única molécula 14,15,34-37. Os detalhes da construção, calibração e operação do dispositivo, incluindo vídeos de instrução, estão disponíveis no site "Pinças Lab" (http://tweezerslab.unipr.it). Aqui, os procedimentos de calibração e as melhorias que precisam ser executadas em bases diárias são descritos em detalhe.
Modificação e solução de problemas em Preparação de Amostras de pinça
Escolha da Vector Clonagem. Embora o esquema geral descrito aqui (Figura 3) não necessita de um vector especial de clonagem, o vector é preferível não ter intrínseca T7 ou T3 promotor para a facilidade de transcrição de tal modo que um promotor pode ser introduzido, através de PCR nas posições desejadas.
Seqüência e comprim…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.
Minitweezers | Steven B. Smith Engineering | http://tweezerslab.unipr.it | |
Data acquisition card | National Instruments | USB-6351 | |
Video card | National Instruments | PCI-1407 | |
Labview programming software | National Instruments | ||
NI Vision Builder | National Instruments | ||
Laser engraver | Epilogue laser systems | Zing-16 | |
PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
MEGAscript T7 kit | Life Technologies | AM1334 | |
MEGAclear kit | Life Technologies | AM1908 | |
Biotin-11-UTP | Thermo Fisher | FERR0081 | |
T4 DNA polymerase | New England Labs | M0203 | |
Streptavidin coated microsphere | Spherotech | SVP-20-5 | |
Antidigoxigenin coated microsphere | Spherotech | DIGP-20-2 | |
Size standard microspheres | Spherotech | PPS-6K | |
Kapton tape | Kaptontape.com | KPPTDE-1 | |
No. 2 cover glass | Thermo Fisher | 12-543D |