JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
생체공학

NANOmanipulação de Solteiro RNA Moléculas por pinça óptica

Published: August 20, 2014
doi:
10.3791/51542
, , ,
1Nanoscale Engineering Graduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering,University at Albany, State University of New York, 2Nanoscale Science Undergraduate Program, College of Nanoscale Science and Engineering,University at Albany, State University of New York, 3Nanobioscience Constellation, College of Nanoscale Science and Engineering,University at Albany, State University of New York, 4The RNA Institute,University at Albany, State University of New York, 5Department of Biological Sciences,University at Albany, State University of New York

Summary

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5’ and 3’ ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Abstract

Uma grande parte do genoma humano é transcrito, mas não traduzidos. Neste pós genómico, as funções reguladoras de RNA foram mostrados para ser cada vez mais importante. Como função de ARN, muitas vezes depende da sua capacidade para adoptar estruturas alternativas, isto é difícil de prever a estrutura tridimensional de ARN directamente a partir da sequência. Uma única molécula de abordagens apresentam potenciais para resolver o problema de polimorfismo de ARN através da monitorização de estruturas moleculares de uma molécula de cada vez. Este trabalho apresenta um método para manipular com precisão o dobramento e estrutura de moléculas de RNA utilizando pinças ópticas. Primeiro, os métodos para sintetizar moléculas adequadas para o trabalho mecânico única molécula são descritos. A seguir, vários procedimentos de calibração para garantir as operações próprias dos pinças ópticas são discutidos. Em seguida, vários experimentos são explicados. Para demonstrar a utilidade da técnica, os resultados de desdobramento mecanicamente grampos de ARN e um único RNA Kissing complexo são usados ​​como prova. Nestes exemplos, a técnica nanomanipulação foi utilizado para estudar dobragem de cada domínio estrutural, incluindo secundário e terciário, de forma independente. Por fim, são discutidas as limitações e as futuras aplicações do método.

Introduction

O desenvolvimento da técnica de pinças ópticas tem sido acompanhada com a sua aplicação no domínio da investigação biológica. Quando o efeito de captura óptica foi descoberto pela primeira vez, Arthur Ashkin observado que as bactérias em água contaminada pode ser preso no foco do laser 1. Desde então, as bactérias trapping tornou-se um involuntário, experiência divertida para gerações de estudantes de biofísica, bem como uma ferramenta de pesquisa séria para estudar a fisiologia microbiana 2,3. A técnica de captura óptica usa raio laser focado para imobilizar um objeto microscópico 1. Na prática, uma série de funções de armadilha de laser como uma fonte óptica, que também mede a força (F) sobre o objecto preso pelo seu deslocamento a partir do centro da armadilha (AX). Dentro de um curto intervalo, F = κ x AX, em κ é a constante da mola de prender. A armadilha óptica pode ser utilizado para exercer uma força em piconewton (pN) de precisão para uma microscopic objeto e medir a sua posição com nanômetros (nm) de precisão. Nas últimas duas décadas, pinças ópticas tornaram-se uma das técnicas de moléculas individuais mais utilizados em biofísica. A técnica tem sido utilizada para estudar e dobragem mecânica de ADN de 4-6, 7-9 de ARN, e proteínas de 10,11. As pinças ópticas também têm sido utilizados para observar a replicação de DNA de 12, a transcrição do RNA 13, e a síntese de proteínas 14,15, bem como muitos outros eventos biomoleculares 16-18.

Abordagens de moléculas individuais são empregadas na pesquisa estrutural RNA principalmente para explorar a paisagem de energia dobrável robusto de RNA. Uma seqüência de RNA geralmente pode dobrar em várias estruturas, que se excluem mutuamente estáveis, devido às regras de composição química e desbastes de base simples de RNA. Tem sido conhecido que o polimorfismo de ARN, como a que ocorre em riboswitches 19,20, desempenha um papel importante na regulação de genes. A recent levantamento de todo o genoma revelou que as variações de temperatura tão pequenas como alguns graus influenciar grandemente a estrutura e síntese de proteínas de grande parte do transcriptoma celular 21. Este exemplo sugere que o papel biológico de alternativa dobrar RNA é talvez mais importante e abrangente do que o suposto anteriormente. Polimorfismo estrutural, no entanto, representa um desafio para as abordagens tradicionais bioquímicos e biofísicos, que examinam as propriedades médias de muitas moléculas. Por exemplo, o "on" e conformações "off" de uma riboswitch são mutuamente exclusivas. Uma estrutura média derivada de estruturas heterogéneas não é provável que se assemelham a um dos confórmeros biologicamente relevantes. Além disso, o ARN não traduzida do mRNA e geralmente formar estruturas. Sua interação com proteínas e RNAs regulatórios comumente requer desdobramento da estrutura existente, como parte da interação. Portanto, estudar RNA desdobramento / redobramento se torna um pertinenteemissão de biologia ARN. Para atender a este desafio, foi empregue uma abordagem única molécula de ARN de desvendar polimorfismo estudando uma molécula de cada vez 22-27.

Em comparação com o método popular de fluorescência única molécula, com base pinça mecânica desdobramento oferece uma vantagem que as conformações das moléculas individuais podem ser manipulados pela força aplicada e ser medido com uma precisão nanométrica. Esta capacidade nanomanipulação pode ser utilizado para monitorar o desdobramento / dobragem de domínios estruturais individuais de tal modo que a dobragem hierárquica de um grande de RNA podem ser dissecados 28. Alternativamente, um único filamento pode ser dirigido a dobrar-se em um dos diversos confórmeros; ou uma estrutura existente pode ser induzida mecanicamente para redobrar a uma conformação diferente 29. Sob condições biológicas, uma estrutura de ARN podem ser alterados em caso de alteração da temperatura ou a ligação do ligando. A capacidade de manipular diretamente s molecularestructure abre um novo espaço de estudo estrutural RNA. Em princípio, outras técnicas mecânicas, tais como microscopia de força atómica e pinças magnéticas, também podem ser usadas para estudar dobra de moléculas de ARN individuais. No entanto, essas aplicações são limitadas em grande parte devido à relativamente baixa resolução espacial de 30.

O emprego de pinças ópticas permite que estruturas de RNA a ser desdobrada pela força mecânica.

A vantagem mecânica desdobramento é várias vezes. Força pode ser usado para desdobrar as estruturas tanto secundárias e terciárias, enquanto íons de metal e ligante induzida dobrável são principalmente limitado a estruturas terciárias. Temperatura e desnaturante pode afetar significativamente as atividades de água e solutos. Em contraste, a força é aplicada localmente para perturbar as estruturas moleculares; o efeito da força sobre o meio ambiente é insignificante. Além disso, a fusão térmica é melhor usado para estudar termodinâmica dobragem de pequenas estruturas de ARN,Considerando que as pinças ópticas têm sido utilizadas para o estudo das estruturas de ARN com vários tamanhos, que vão desde um de sete pares de bases tetraloop grampo 28 para um ribozima 400 nucleótidos 31. Além disso, as estruturas de ARN pode ser desdobrada mecanicamente a temperaturas mesófilas. Em contraste, os ARN de se desdobrar em uma experiência de fusão térmica, a temperatura é normalmente levantada bem acima das temperaturas fisiológicas, o que aumenta significativamente a hidrólise de ARN, especialmente na presença de iões Mg2 +.

É importante notar que o efeito da força mecânica depende de como ele é aplicado a uma estrutura. A força aplicada inclina o panorama energético dobrar. Por exemplo, quando a força é aplicada a um gancho de cabelo, as pares de bases são sequencialmente quebrada, um de cada vez (Figura 1-A). O garfo rasgando progride ao longo do eixo helicoidal, que é perpendicular à força aplicada. Em contraste, quando um complexo de beijos mínima está sob tensão, os dois kissingpares de bases, que são paralelas à força aplicada, partilhar a carga de força (Figura 1b). As diferentes geometrias do gancho e kissing relativamente complexo para o resultado a força aplicada na sua resposta mecânica diferentes, que podem ser utilizados para distinguir dobragem secundário e terciário 28,32. O aspecto teórico da mecânica desdobramento foi previamente analisado 8,9,30. Este trabalho descreve as abordagens básicas para configurar e executar uma única molécula de ensaio desdobramento mecânico.

Configuração Experimental. Na nossa experiência, puxando mecânica, a amostra de ARN para pinça consiste no ARN de interesse ladeado por duas pegas de ADN / ARN de cadeia dupla (Figura 2) 7. Toda a molécula pode ser amarrado a dois micro-grânulos revestidos de tamanho de superfície (SPHEROTECH) através de estreptavidina-biotina e as interacções de anticorpos anti-digoxigenina-digoxigenina, respectivamente. Um cordão é realizada por um tr óptico de medição de forçaap, enquanto que a outra é mantida na ponta de uma micropipeta. A distância relativa entre os grânulos pode ser alterada por dirigir o movimento da armação ou da micropipeta. Usando esta abordagem, uma única molécula de ARN de amarrar os grânulos pode ser esticado e relaxado.

Preparação de Amostras. A síntese das amostras de ARN para pinça inclui alguns passos (Figura 3). Em primeiro lugar, a sequência de DNA correspondente ao RNA de interesse é clonado em primeiro lugar num vector de plasmídeo. Em seguida, três reacções de PCR são realizadas para gerar as duas alças e um molde para a transcrição. O modelo de transcrição engloba as regiões do puxador e as sequências inseridas. O ARN completo é sintetizado por transcrição in vitro. Por último, o ARN e alças quimicamente modificados são hibridados em conjunto para gerar as moléculas de pinça.

Calibração e Operação de pinças. O projeto básico do uso Minitweezersd neste trabalho segue a dos dual-feixe de pinças ópticas 33. Com muitos melhoramentos, os Minitweezers exibir extraordinária estabilidade, em comparação com as pinças ópticas da primeira geração. Um certo número de grupos de pesquisa em vários países usam os Minitweezers em sua pesquisa uma única molécula 14,15,34-37. Os detalhes da construção, calibração e operação do dispositivo, incluindo vídeos de instrução, estão disponíveis no site "Pinças Lab" (http://tweezerslab.unipr.it). Aqui, os procedimentos de calibração e as melhorias que precisam ser executadas em bases diárias são descritos em detalhe.

Protocol

1 Preparação de RNA Moléculas por uma única molécula Arrancar A clonagem da sequência de interesse. Clonar a sequência de ADN correspondente à estrutura de ARN em um vector. Síntese e purificação de molde a transcrição. Sintetizar um molde por PCR de transcrição. [Tabela 1 aqui lugar] Em seguida, purificar os produtos de PCR, utilizando um kit de purificação de PCR, e concentrar a amostra para> 200 ng / mL. Uma vez que o ADN purificado é usado para a transcrição, de RNase isen…

Representative Results

Limitado pelo espaço, nanomanipulação de moléculas de RNA é demonstrado ao mostrar apenas exemplos desdobramento mecânicas dos grampos de RNA e RNA com uma estrutura terciária. Manipular Único Hairpin Moléculas Uma vez que uma corrente é estabelecida entre as esferas, a extensão do e vigor na corda pode ser manipulado através de um protocolo definido pelo usuário. Quatro protocolos comuns de manipulação são comumente usados. <…

Discussion

Modificação e solução de problemas em Preparação de Amostras de pinça

Escolha da Vector Clonagem. Embora o esquema geral descrito aqui (Figura 3) não necessita de um vector especial de clonagem, o vector é preferível não ter intrínseca T7 ou T3 promotor para a facilidade de transcrição de tal modo que um promotor pode ser introduzido, através de PCR nas posições desejadas.

Seqüência e comprim…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by an NSF grant (MCB-1054449) and a collaborative interdisciplinary Pilot Research Program award from The RNA Institute at University at Albany to PTXL.

Materials

Minitweezers Steven B. Smith Engineering http://tweezerslab.unipr.it
Data acquisition card National Instruments USB-6351
Video card National Instruments PCI-1407
Labview programming software National Instruments
NI Vision Builder National Instruments
Laser engraver Epilogue laser systems Zing-16
PCR purification kit Qiagen 28104
MEGAscript T7 kit Life Technologies AM1334
MEGAclear kit Life Technologies AM1908
Biotin-11-UTP Thermo Fisher FERR0081
T4 DNA polymerase New England Labs M0203
Streptavidin coated microsphere Spherotech SVP-20-5
Antidigoxigenin coated microsphere Spherotech DIGP-20-2
Size standard microspheres Spherotech PPS-6K
Kapton tape Kaptontape.com KPPTDE-1
No. 2 cover glass Thermo Fisher 12-543D
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ashkin, A. Optical trapping and manipulation of neutral particles using lasers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 4853-4860 (1997).
  2. Maier, B. Using laser tweezers to measure twitching motility in Neisseria. Current opinion in microbiology. 8, 344-349 (2005).
  3. Wang, S., Arellano-Santoyo, H., Combs, P. A., Shaevitz, J. W. Measuring the bending stiffness of bacterial cells using an optical trap. Journal of visualized experiments JoVE. , (2010).
  4. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. . Overstretching B-DNA the elastic response of individual double-stranded and single-stranded DNA molecules. 271, 795-799 (1996).
  5. Strick, T. R., Allemand, J. F., Bensimon, D., Bensimon, A., Croquette, V. . The elasticity of a single supercoiled DNA molecule. 271, 1835-1837 (1996).
  6. Bryant, Z., et al. Structural transitions and elasticity from torque measurements on DNA. Nature. 424, 338-341 (2003).
  7. Liphardt, J., Onoa, B., Smith, S. B., Tinoco, I., J, C., Bustamante, . Reversible unfolding of single RNA molecules by mechanical force. 292, 733-737 (2001).
  8. Li, P. T. X., Vieregg, J., Tinoco, I. How RNA unfolds and refolds. Annu Rev Biochem. 77 (27), 21-24 (2008).
  9. Woodside, M. T., Garcia-Garcia, C., Block, S. M. Folding and unfolding single RNA molecules under tension. Current opinion in chemical biology. 12, 640-646 (2008).
  10. Cecconi, C., Shank, E. A., Bustamante, C., Marqusee, S. . Direct observation of the three-state folding of a single protein molecule. 309, 2057-2060 (2005).
  11. Shank, E. A., Cecconi, C., Dill, J. W., Marqusee, S., Bustamante, C. The folding cooperativity of a protein is controlled by its chain topology. Nature. 465, 637-640 (2010).
  12. Morin, J. A., et al. Active DNA unwinding dynamics during processive DNA replication. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 8115-8120 (2012).
  13. Larson, M. H., Landick, R., Block, S. M. Single-molecule studies of RNA polymerase one singular sensation every little step it takes. Molecular cell. 41, 249-262 (2011).
  14. Wen, J. D., et al. Following translation by single ribosomes one codon at a time. Nature. 452, 598-603 (2008).
  15. Qu, X., et al. The ribosome uses two active mechanisms to unwind messenger RNA during translation. Nature. 475, 118-121 (2011).
  16. Pease, P. J., et al. . Sequence-directed DNA translocation by purified FtsK. 307, 586-590 (2005).
  17. Dumont, S., et al. RNA translocation and unwinding mechanism of HCV NS3 helicase and its coordination by ATP. Nature. 439, 105-108 (2006).
  18. Greenleaf, W. J., Woodside, M. T., Block, S. M. High-resolution, single-molecule measurements of biomolecular motion. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 36, 171-190 (2007).
  19. Serganov, A., Nudler, E. A decade of riboswitches. Cell. 152, 17-24 (2013).
  20. Breaker, R. R. Prospects for riboswitch discovery and analysis. Molecular cell. 43, 867-879 (2011).
  21. Wan, Y., et al. Genome-wide measurement of RNA folding energies. Molecular cell. 48, 169-181 (1016).
  22. Dalgarno, P. A., et al. Single-molecule chemical denaturation of riboswitches. Nucleic acids research. 41, 4253-4265 (2013).
  23. Wood, S., Ferre-D’Amare, A. R., Rueda, D. Allosteric tertiary interactions preorganize the c-di-GMP riboswitch and accelerate ligand binding. ACS chemical biology. 7, 920-927 (2012).
  24. Brenner, M. D., Scanlan, M. S., Nahas, M. K., Ha, T., Silverman, S. K. Multivector fluorescence analysis of the xpt guanine riboswitch aptamer domain and the conformational role of guanine. 생화학. 49, 1596-1605 (2010).
  25. Greenleaf, W. J., Frieda, K. L., Foster, D. A., Woodside, M. T., Block, S. M. . Direct observation of hierarchical folding in single riboswitch aptamers. 319, 630-633 (2008).
  26. Frieda, K. L., Block, S. M. . Direct observation of cotranscriptional folding in an adenine riboswitch. 338, 397-400 (2012).
  27. Neupane, K., Yu, H., Foster, D. A., Wang, F., Woodside, M. T. Single-molecule force spectroscopy of the add adenine riboswitch relates folding to regulatory mechanism. Nucleic acids research. 39, 7677-7687 (2011).
  28. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Unusual Mechanical Stability of A Minimal RNA Kissing Complex. Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15847-15852 (2006).
  29. Li, P. T. X., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Real-time control of the energy landscape by force directs the folding of RNA molecules. Proc Natl Acad Sci USA. 104, 7039-7044 (2007).
  30. Tinoco Jr, I., Li, P. T. X., Bustamante, C. Determination of ther modynamics and kinetics of RNA reactions by force. Q Rev Biophys. 39, 325-360 (2006).
  31. Onoa, B., et al. . Identifying kinetic barriers to mechanical unfolding of the T thermophila ribozyme. 299, 1892-1895 (2003).
  32. Li, P. T., Tinoco Jr, I. Mechanical unfolding of two DIS RNA kissing complexes from HIV-1. J Mol Biol. 386, 1343-1356 (2009).
  33. Smith, S., Cui, Y., Bustamante, C. Optical-trap force transducer that operates by direct measurement of light momentum. Methods Enzymol. 361, 134-162 (2003).
  34. Stephenson, W., et al. The essential role of stacking adenines in a two-base-pair RNA kissing complex. J Am Chem Soc. 135, 5602-5611 (2013).
  35. Kaiser, C. M., Goldman, D. H., Chodera, J. D., Tinoco Jr, I., Bustamante, C. . The ribosome modulates nascent protein folding. 334, 1723-1727 (2011).
  36. Bizarro, C. V., Alemany, A., Ritort, F. Non-specific binding of Na+ and Mg2+ to RNA determined by force spectroscopy methods. Nucleic acids research. 40, 6922-6935 (2012).
  37. Bosaeus, N., et al. Tension induces a base-paired overstretched DNA conformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 15179-15184 (2012).
  38. Berg-Sørensen, K., Power Flyvbjerg, H. spectrum analysis for optical tweezers. Rev Sci Instrum. 75, 594-612 (2004).
  39. Stephenson, W., et al. Combining temperature and force to study folding of an RNA hairpin. Phys Chem Chem Phys. 16, 906-917 (2014).
  40. Evans, E., Ritchie, K. Dynamic strength of molecular adhesion bonds. Biophys J. 72, 1541-1555 (1997).
  41. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Intrinsic rates and activation free energies from single-molecule pulling experiments. Phys Rev Lett. 96, 108101 (2006).
  42. Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. Theory analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments. Proc. Natl Acad Sci USA. 105, 15755-15760 (2008).
  43. Li, P. T. X., Collin, D., Smith, S. B., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Probing the Mechanical Folding Kinetics of TAR RNA by Hopping, Force-Jump and Force-Ramp Methods. Biophys J. 90, 250-260 (2006).
  44. Elms, P. J., Chodera, J. D., Bustamante, C. J., Marqusee, S. Limitations of constant-force-feedback experiments. Biophysical journal. 103, 1490-1499 (2012).
  45. Li, P. T. X. Analysis of Diffuse K+ and Mg2+ Ion Binding to a Two-Base-Pair Kissing Complex by Single-Molecule Mechanical Unfolding. 생화학. 52, 4991-5001 (2013).
  46. Wen, J. D., et al. Force unfolding kinetics of RNA using optical tweezers. I. Effects of experimental variables on measured results. Biophys J. 92, 2996-3009 (2007).
  47. Manosas, M., et al. Force Unfolding Kinetics of RNA using Optical Tweezers II. Modeling Experiments Biophys J. 92, 3010-3021 (2007).
  48. Vilfan, I. D., et al. An RNA toolbox for single-molecule force spectroscopy studies. Nucleic acids research. 35, 6625-6639 (2007).
  49. Li, P. T. X. Formation of a metastable intramolecular RNA kissing complex by nanomanipulation. Soft Matter. 9, 3246-3254 (2013).
  50. Chen, G., Chang, K. Y., Chou, M. Y., Bustamante, C., Tinoco Jr, I. Triplex structures in an RNA pseudoknot enhance mechanical stability and increase efficiency of -1 ribosomal frameshifting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 12706-12711 (2009).
  51. Chen, G., Wen, J. D., Tinoco Jr, I. . Single-molecule mechanical unfolding and folding of a pseudoknot in human telomerase RNA. 13, 2175-2188 (2007).
  52. Tinoco, I., Chen, G., Qu, X. RNA reactions one molecule at a time. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 2, a003624 (2010).
  53. Dudko, O. K., Graham, T. G., Best, R. B. Locating the barrier for folding of single molecules under an external force. Physical review letters. , 107-208301 (2011).
  54. Djebali, S., et al. Landscape of transcription in human cells. Nature. 489, 101-108 (2012).

Tags

Single RNA MoleculesOptical TweezersNanomanipulationRNA StructureRNA FoldingSingle-molecule ApproachesRNA Structural PolymorphismRNA HairpinsRNA Kissing ComplexTertiary StructureSecondary Structure

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stephenson, W., Wan, G., Tenenbaum, S. A., Li, P. T. X. Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers. J. Vis. Exp. (90), e51542, doi:10.3791/51542 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image