Inverser approche Morpholino génétique utilisant cardiaque ventriculaire injection à Transfecter tissus difficiles à cibles multiples dans le poisson zèbre Larve
Summary
Un procédé de génétique inverse adapté pour un poisson zèbre pour déterminer la fonction des gènes au cours des stades ultérieurs de développement et de l'homéostasie physiologique tel que la régénération des tissus en utilisant des injections intraventriculaires de morpholinos spécifiques d'un gène.
Abstract
Le poisson zèbre est un modèle important de comprendre la biologie cellulaire et moléculaire de l'orgue et appendice régénération. Cependant, les stratégies moléculaires pour employer la génétique inverse ne sont pas encore suffisamment développées pour évaluer la fonction d'un gène dans la régénération ou l'homéostasie tissulaire au cours de stades larvaires après l'embryogenèse poisson-zèbre, et de plusieurs tissus dans la larve de poisson zèbre est difficile à cibler. Injections intraventriculaires de morpholinos spécifiques d'un gène offrent une méthode alternative pour l'incapacité actuelle à une cible, sur le plan génomique de poisson zèbre gènes d'une manière contrôlée dans le temps à ces stades. Cette méthode permet une dispersion complète et l'incorporation ultérieure de la morpholino dans divers tissus du corps, y compris les structures qui étaient auparavant impossible à atteindre telles que celles de la nageoire caudale larvaire, une structure souvent utilisée pour la recherche de manière non invasive la régénération des tissus. Plusieurs gènes activés au cours des larves régénération finfold sont également présentationt dans la régénération de tissus de vertébrés adulte, si la larve est un modèle utile pour comprendre la régénération chez les adultes. Ce procédé de dispersion morpholino permet l'identification rapide et facile des gènes requis pour la régénération des tissus larvaires ainsi que d'autres phénomènes physiologiques régulant l'homéostasie tissulaire après l'embryogenèse. Par conséquent, ce mode de livraison fournit une stratégie actuellement nécessaires pour le contrôle temporel de l'évaluation de la fonction des gènes après l'embryogenèse.
Introduction
Régénération des organes et des appendices est d'une importance fondamentale pour la survie et remise en forme; Toutefois, plusieurs vertébrés, y compris l'homme ont limité capacités régénératrices. Bien que plusieurs modèles animaux existent qui ont une vaste capacité de régénération, inverser techniques génétiques pour évaluer la fonction des gènes au cours de l'orgue et appendice régénération reste très limitée ou inexistante. Par conséquent, de nouvelles approches sont nécessaires pour disséquer la biologie moléculaire de la régénération dans ces organismes modèles.
Le poisson zèbre est un modèle bien établi pour la compréhension de la biologie cellulaire et moléculaire de l'orgue et appendice régénération 1, non seulement en raison de son importante capacité de régénérer plusieurs organes, de tissus et des appendices, mais aussi parce que plusieurs lignes de poissons transgéniques existent pour suivre les cellules et surexpriment le gène construit 2, 3. Cependant, l'inhibition du gène chez le poisson zèbre larves se limite essentiellement à la overexpression de constructions dominants négatifs, qui ne sont pas disponibles pour tous les gènes d'intérêt ou dont le produit transgène peut acquérir un gain de fonction des effets qui ne reflètent pas l'activité endogène du gène. Ainsi, une méthode alternative pour éliminer spécifiquement l'expression des gènes par KO ou effet de choc est nécessaire pour surmonter ces problèmes.
Gène spécifique ciblant l'aide TALENS existe comme un moyen de génétique inverse pour Knockout la fonction des gènes; Toutefois, cette stratégie de knock-out est très souvent limitée à des évaluations fonctionnelles au cours de l'embryogenèse précoce, parce que les exigences initiales du gène empêchent la progression du développement embryonnaire. Ainsi, l'étude des phénomènes ultérieurs tels que la régénération ou l'homéostasie des organes après le développement à l'aide TALENS est exclue 4, 5. Par conséquent, une stratégie d'élimination de gène de remplacement est nécessaire que la fonction du gène cible après le développement précoce d'évaluer les besoins de gènes dans les organes et structures complètement formés. </p>
Morpholino injection a été montré pour être efficace dans le ciblage de gènes dans quelques organes adultes et l'adulte régénération nageoire 6-8, mais ces méthodes nécessitent l'électroporation et de nombreux organes internes sont difficiles à électroporation soit en raison de leur emplacement ou de leur sensibilité à l'électrique perturbation. En outre, certains tissus de la larve sont difficiles à injecter directement, car l'injection directe peut perturber leur intégrité structurelle ou parce que leur taille est limitant. La nageoire caudale de la chenille est une telle structure, car une injection directe dans le finfold n'est pas possible. Ainsi, une alternative à l'électroporation et l'injection directe a été nécessaire pour cibler des gènes dans des tissus qui sont soit trop petite pour injecter ou ne peut pas être soumis à une électroporation.
Afin de cibler et d'inhiber la fonction de gènes spécifiques au cours de la régénération de la nageoire caudale larvaire, nous avons modifié les technologies existantes permettant morpholino l'unÉVALUATION de la fonction des gènes lors de la régénération de la nageoire caudale dans larve de fin de mise en scène. Cette méthode emploie livraison intraventriculaire 9 de marqué à la fluorescéine morpholinos avec Endo-Porter réactif de transfection 10. Une fois dans le ventricule, le mélange morpholino-Endo-Porter se propage rapidement à travers la larve via le système vasculaire et pénètre dans les tissus qui ont été auparavant impossible à cibler. Cette méthode d'injection peut être modifié pour cibler des gènes dans des tissus spécifiques et très probablement peut être appliquée dans d'autres modèles animaux qui n'ont pas actuellement de méthodes de génétique inverse pour inhiber la fonction des gènes. Ainsi, il offre une méthode rapide et facile avec le potentiel pour une large utilisation de la gamme d'étudier immédiatement la fonction des gènes au cours de l'homéostasie des organes général et la régénération au stade larvaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'injection intraventriculaire fournit une méthode d'évaluation rapide et fiable pour tester la fonction des gènes à des stades ultérieurs du développement ou de l'homéostasie du corps sans affecter la fonction des gènes au cours de l'embryogenèse. Pour assurer le succès de cette technique, il faut être conscient de quatre points essentiels: 1) la taille de l'aiguille, 2) le séchage de l'aiguille, 3) réduire au minimum le volume, et 4) la durée d'exposition minimale à la soluti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), nous tenons à remercier Ayele Tsedeke Taddese pour le support technique.
Materials
| Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| Reagent/Material | |||
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information on www.genetools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information on www.genetools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricane (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSo4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Equipment | |||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming / Brown needle puller | Sutter | More information on www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
References
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. . Zebrafish: a practical approach. 261, 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D’Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
