Zebrafish의 유충의 여러 어려운 대상 조직을 형질 심장 심실 사출을 사용하여 유전 모르 폴리 노의 접근을 반전

요약

이러한 유전자의 특정 morpholinos와의 뇌 실내 주사를 사용하여 조직 재생 등의 개발 및 생리 학적 항상성 이후 단계에서 유전자 기능을 평가하는 제브라 피쉬에 대한 적응력이 역 유전 방법.

초록

제브라 피쉬는 세포와 기관 및 부속 기관 재생의 분자 생물학을 이해하는 중요한 모델입니다. 그러나, 역 유전학을 사용하는 분자 전략은 아직 충분히 제브라 피쉬 배아 후 유생 단계 동안 재생 또는 조직의 항상성의 유전자 기능을 평가하기 위해 개발되지 않은, 그리고 제브라 피쉬의 유충 내에서 여러 조직을 대상으로하기 어렵다. 유전자 특정 morpholinos와의 뇌 실내 주사는 유 전적으로 이러한 단계에서 일시적으로 통제 된 방식으로 zebrafish의 유전자를 표적으로하는 현재의 무능력에 대한 대체 방법을 제공합니다. 이 방법은 이전과 같은 유생의 꼬리 지느러미, 종종 비 침습적 조직 재생을 연구하는 데 사용되는 구조에서와 도달하기 불가능했던 구조 등 신체 전반에 걸쳐 다양한 조직에 완전 분산 모르 폴리 노의 연속 편입 할 수 있습니다. 애벌레 finfold 재생하는 동안 활성화 몇 가지 유전자는 프리젠됩니다성인 척추 조직의 재생에 t, 그래서 애벌레는 성인의 재생을 이해하는 데 유용한 모델입니다. 이 모르 폴리 노 분산 방법은 애벌레 조직의 재생뿐만 아니라 배아 후 조직의 항상성을 조절하는 다른 생리 현상에 필요한 유전자를 빠르고 쉽게 식별 할 수 있습니다. 따라서, 이러한 전달 방법은 배아 발생 후의 유전자 기능의 평가에 시간적 제어에 대한 현재 필요한 전략을 제공한다.

서론

장기와 부속의 재생은 생존과 피트니스에 대한 근본적으로 중요하다 그러나, 사람 등 여러 가지 척추 동물은 재생 능력을 제한했다. 여러 동물 모델은 광범위한 재생 능력을 가지고 존재하지만, 기관 및 부속 기관 재생하는 동안 유전자 기능을 평가하기 위해 유전자 기술을 반전은 매우 제한적이거나 존재하지 않는 남아 있습니다. 따라서 새로운 접근 방식은 이러한 모델 생물에서 중생의 분자 생물학을 해부하는 데 필요합니다.

제브라 피쉬는 여러 유전자 ​​변형 물고기 라인이 세포를 추적하기 위해 존재하기 때문에 셀 때문에 중요한 여러 장기, 조직 및 부속을 다시 생성 할 수있는 능력뿐만 아니라,의뿐만 아니라 기관 및 부속 기관 재생 ^1, 분자 생물학을 이해하기위한 기초가 튼튼한 모델입니다 유전자를 과발현하는 것은 ^{2, 3를} 구성한다. 그러나, 유생 지브라 피쉬의 유전자 억제는 주로 overexpre에 한정누구의 유전자 제품 유전자의 내인성 활성을 반영하지 않습니다 이득의 기능 효과를 얻을 수있는 모든 관심의 유전자 또는 사용할 수없는 지배적 인 음성 구조의 (투약) 소지. 따라서, 구체적으로 녹아웃 또는 넉다운하여 유전자 발현을 제거하는 다른 방법은 이러한 문제를 극복하기 위해 필요하다.

프로토콜

1. 유리 바늘의 준비 (그림 1)

1. 주사 바늘 (그림 1A)를 준비하기 위해 825 ㎜의 유리 모세관을 사용합니다.
2. 바늘 풀러에 유리 모세관을 놓고 다음과 같은 매개 변수를 사용하여 바늘을 당겨 : 난방 사이클 값 : 463; 사이클 값 당기는 : 230; 속도 : 150 밀리 초; 시간 : 150 밀리 초 (그림 1B).
3. 마이크로 미터의 접안 렌즈와 입체경에서 20 μm의 직경 바늘을 생산하는 시계 제조 핀셋 뽑아 유리 모세관 휴식.
4. 바늘을 날카롭게하고 20 μm의 경사 (그림 1C 및 1D)를 생산하기 위해 젖은 고무 물레와 선반을 사용합니다. 참고 : 샤프 빗면 바늘 뇌실에 삽입의 용이성을 향상시키고, 따라서 조직에 손상을 최소화하고 천공 근육 바늘 (도 1E-G)의 제거 후에 다시 봉인하는 것을 허용한다.

2. Prepar모르 폴리 솔루션의 ATION

1. 7.5 mM의 최종 농도로 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에서 동결 건조 된 모르 폴리 용해시켜 모르 폴리 콘텐츠를 준비한다....

결과

(그림 3A) 등쪽으로 접근하면 날카로운, 경 주사 바늘을 ​​쉽게 제브라 피쉬의 유충의 심장 심실에 배치됩니다. 마음은 바늘 (그림 3B 및 3C)의 존재에도 불구하고 펌핑을 계속하고 혈액의 흐름이 유지됩니다. 조심 주사는 심장 (그림 3E)에 모르 폴리 노의 분사에도 불구하고 심실 또는 심장 수축 (그림 3D)의 형태를 방해하지 않습니다.

분 이내, 모르 폴리 노 - 엔도 - 포터 솔루션은 혈관 (그림 4a 및도 4b)를 통해 몸 전체에 배포합니다. 모르가 다음과 같은 최소 12 시간 또는 형광 (그림 4C)에서 관찰 더의 finfold 뇌와 같은 다른 조직으로 혈관에서 배포됩니다.

이 방법에서는, 우리는 일의 .......

토론

뇌 실내 주입은 배아 발생 동안 유전자 기능에 영향을주지 않고 전개 또는 신체 항상성의 나중 단계에서 유전자 기능을 테스트하기위한 신속하고 신뢰성있는 평가 방법을 제공한다. 이 기술의 성공을 보장하기 위해, 하나는 네 가지 중요한 점을 알고 있어야합니다 바늘의 중 1) 바늘 크기, 2) 건조, 3) 양을 최소화하고, 진정 솔루션 4) 최소한의 노출 시간. 너무 큰 바늘 심실 손상과 과다 출혈의 원인이됩니다 동안 너무 작은 바늘은 자주 막히게됩니다. 20 μm의 권장하지만, 바늘 이상 5 분의 1 심실 챔버의 크기 않을 것입니다. 두 번째 중요한 점은 건조하고 막히는 바늘을 유지하는 것입니다. 진정, 전송 및 위치 유충에 바늘과 피할 수없는 자주 일시 정지의 작은 크기는 바늘 끝에서 모르가 건조하고 바늘을 방해 할 수있는 충분한 시간을 제공 할 수 있습니다. 방지하기 위해이것은, 하나의 1X PBS의 페트리 접시에 바늘 젖어있다. 세 번째 중요한 점은 볼륨이 너무 높은 의해 심실의 팽만감을 최소화하는 것입니다. 투약은 바늘의 크.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3´를 가진 Morpholino; 플루오레세인 태그	Gene Tools Inc.	맞춤형	추가 정보 www.gene-tools.com
Endo-Porter	Gene Tools Inc.		www.gene-tools.com
Agarose	Serva	120623	주사 중 물고기를 놓기 위한 주입 플레이트를 붓고
트리카인(L-에틸-m-아미노-벤제이트-메탄 설포네이트)	Applichem		마취용
E3 배지(5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl<>sub2; 0.33 mM MgSO4)			를
페트리 접시	Sarstedt	821.472	주사 중 물고기를 배치하고 이미징
Thin Wall Glass Capillaries	World Precision Instruments, Inc.	TW100F-3	주사 바늘 준비용
Microloader 피펫 팁	Eppendorf	5,242,956,003	바늘 로딩용
파스퇴르 피펫 (3 ml/1 ml)	브랜드	747760/ 74775	유충 이송용
Flaming/Brown needle puller	Sutter		www.sutter.com
Watchmaker (Dumont) 핀셋 (크기 5)	World Precision 인스트루먼트, Inc.	501985	날카롭게하기 전에 바늘을 제동하려면
해부 현미경	올림푸스, 라이카, 자이스	제조업체에 따라 다름	전체 주입 설정의 일부
형광 카메라	올림푸스, 라이카, 자이스	제조업체에 따라 다름	injeciton
PicoNozzle 키트 (마이크로 인젝터 홀더)	World Precision Instruments	5430-12	용 미세주입
공압 PicoPump (microinjector)	World Precision Instruments	SYS-PV820	미세주입용

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