Invierta genética Enfoque Morpholino Usando ventricular cardíaca inyección para transfectar múltiples tejidos difíciles de conectar por objetivo en el pez cebra Larva
Summary
Un método de genética inversa adaptable para el pez cebra para evaluar la función de genes durante las etapas posteriores del desarrollo y la homeostasis fisiológica, tales como la regeneración de tejidos usando inyecciones intraventriculares de morfolinos de genes específicos.
Abstract
El pez cebra es un modelo importante para comprender la biología celular y molecular de la regeneración de órganos y apéndice. Sin embargo, las estrategias moleculares para emplear genética inversa todavía no se han desarrollado adecuadamente para evaluar la función del gen en la regeneración o la homeostasis del tejido durante las etapas de larvas de pez cebra después de la embriogénesis, y varios tejidos dentro de la larva de pez cebra son difíciles de orientar. Inyecciones intraventriculares de morfolinos de genes específicos ofrecen un método alternativo para la incapacidad actual para apuntar genómicamente genes de pez cebra de una manera controlada temporalmente en estas etapas. Este método permite la dispersión completa y la posterior incorporación de la morfolino en varios tejidos de todo el cuerpo, incluyendo estructuras que antes eran imposibles de alcanzar, tales como los de la aleta caudal de larvas, una estructura a menudo utilizado para investigar de forma no invasiva la regeneración de tejidos. Varios genes activados durante la regeneración pliegue de la aleta larval también se Present en la regeneración de tejidos de vertebrados adultos, por lo que la larva es un modelo útil para entender la regeneración en adultos. Este método de dispersión morfolino permite la identificación rápida y fácil de los genes necesarios para la regeneración de los tejidos de las larvas, así como otros fenómenos fisiológicos que regulan la homeostasis del tejido después de la embriogénesis. Por lo tanto, este método de entrega proporciona una estrategia necesaria en la actualidad para el control temporal de la evaluación de la función de genes después de la embriogénesis.
Introduction
La regeneración de órganos y apéndices es de fundamental importancia para la supervivencia y la aptitud; sin embargo, varios vertebrados, incluido el hombre han limitado las capacidades regenerativas. Aunque existen varios modelos animales que tienen una amplia capacidad de regeneración, las técnicas de genética inversa para evaluar la función de genes durante la regeneración de órganos y apéndices siguen siendo muy limitada o inexistente. Por lo tanto, se necesitan nuevos enfoques para diseccionar la biología molecular de la regeneración en estos organismos modelo.
El pez cebra es un modelo bien establecido para la comprensión de la biología celular y molecular de la regeneración de órganos y apéndice 1, no sólo debido a su capacidad significativa para regenerar múltiples órganos, tejidos y apéndices, sino también porque existen varias líneas de peces transgénicos para rastrear las células y para sobreexpresar genes construye 2, 3. Sin embargo, la inhibición de genes en larvas de pez cebra se limita principalmente a la overexpression de las construcciones dominantes negativos, que no están disponibles para todos los genes de interés o cuyo producto transgénico puede adquirir con ganancia de función de los efectos que no reflejan la actividad endógena del gen. Por lo tanto, se necesita un método alternativo para eliminar específicamente la expresión de genes por knockout o knockdown para superar estos problemas.
Específica la orientación de genes usando TALENS existe como un medio de genética inversa para octavos de final la función de genes; Sin embargo, esta estrategia eliminatoria es muy limitado con frecuencia a evaluaciones funcionales durante la embriogénesis temprana, porque los requisitos iniciales del gen impiden la progresión del desarrollo embrionario. Por lo tanto, el estudio de los fenómenos posteriores como la regeneración o la homeostasis de órganos después de desarrollo utilizando TALENS está impedido 4, 5. Por lo tanto, se necesita una estrategia alternativa de eliminación de genes que se dirige a la función de genes después del desarrollo temprano para evaluar los requisitos de genes en los órganos y estructuras completamente formados. </p>
Morfolino inyección se ha demostrado ser eficaz en la orientación de los genes en un par de órganos de adultos y el adulto regeneración de aleta 6-8, pero estos métodos requieren la electroporación y muchos órganos internos son difíciles de electroporar ya sea debido a su ubicación o debido a su sensibilidad a eléctrica interrupción. Por otra parte, algunos tejidos de la larva son difíciles de inyectar directamente, ya que la inyección directa puede alterar su integridad estructural o porque su tamaño es limitante. La aleta caudal de la larva es un tal estructura, debido a la inyección directa en el pliegue de la aleta no es posible. Por lo tanto, se necesita una alternativa a la electroporación y la inyección directa de los genes objetivo en los tejidos que son demasiado pequeña para inyectar o no puede ser a electroporación.
Con el fin de dirigir e inhibir la función de genes específicos durante la regeneración de la aleta caudal de larvas, hemos modificado tecnologías de morfolino existentes permitiendo que el unVALUACIÓN de la función génica durante la regeneración de la aleta caudal en larva-etapas finales. Este método emplea la entrega intraventricular 9 de morfolinos fluoresceína etiquetado junto con Endo-Porter transfección reactivo 10. Una vez en el ventrículo, la mezcla morfolino-Endo-Porter se propaga rápidamente a través de la larva a través de la vasculatura y entra en los tejidos que han sido previamente imposible para apuntar. Este método de inyección puede ser modificado para los genes objetivo en tejidos específicos y muy posiblemente puede ser aplicado en otros modelos animales que actualmente carecen de métodos de genética inversa para inhibir la función del gen. Así, se ofrece un método rápido y fácil con el potencial de uso de gama amplia para estudiar de inmediato la función de genes durante la homeostasis de órganos en general y la regeneración en las etapas larvales.
Protocol
Representative Results
Discussion
La inyección intraventricular proporciona un método de evaluación rápida y fiable para probar la función de genes en las etapas posteriores del desarrollo o de la homeostasis del cuerpo sin afectar a la función del gen durante la embriogénesis. Para asegurar el éxito de esta técnica, uno debe ser consciente de los cuatro puntos críticos: 1) Tamaño de la aguja, 2) la desecación de la aguja, 3) reducir al mínimo el volumen, y 4) el tiempo mínimo de exposición en la solución de la sedación. Agujas que son …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), queremos agradecer Ayele Tsedeke Taddese para soporte técnico.
Materials
| Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| Reagent/Material | |||
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information on www.genetools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information on www.genetools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricane (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSo4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Equipment | |||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming / Brown needle puller | Sutter | More information on www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
References
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