הפוך גישת morpholino גנטית באמצעות הזרקת לב חדרית לtransfect רקמות קשה ליעד מרובים בזחל דג הזברה
Summary
שיטה להתאמה הפוכה גנטית לדג זברה כדי להעריך את תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות והומאוסטזיס פיסיולוגי כגון התחדשות רקמות באמצעות זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי.
Abstract
דג הזברה הוא מודל חשוב להבין את התא וביולוגיה מולקולרית של איבר והתחדשות סרח. עם זאת, אסטרטגיות מולקולריות להעסיק גנטיקה הפוכה עדיין לא פותחו במידה מספקת כדי להעריך את תפקוד גן בהתחדשות או הומאוסטזיס רקמות בשלבי זחל אחרי עובר דג הזברה, וכמה רקמות בתוך זחל דג הזברה הן קשות להתמקד. זריקות תוך חדרי של morpholinos גן ספציפי להציע שיטה חלופית לחוסר היכולת הנוכחית למקד genomically גנים דג הזברה באופן temporally מבוקר בשלבים האלה. שיטה זו מאפשרת לפיזור מלא ושילוב הבא של morpholino לרקמות שונות בגוף, כוללים מבנים שהיו בעבר בלתי אפשריים להגיע כגון אלה בסנפיר הזנב הזחל, מבנה המשמש לעתים קרובות כדי לחקור התחדשות רקמות noninvasively. מספר גנים מופעלים במהלך רגנרציה finfold זחל גם presenלא בהתחדשות רקמות חוליות מבוגרים, ולכן הזחל הוא מודל שימושי כדי להבין התחדשות במבוגרים. שיטת פיזור morpholino זה מאפשרת זיהוי קל ומהיר של גנים הנדרשים להתחדשות של רקמות זחל כמו גם תופעות פיסיולוגיות אחרות המסדירות הומאוסטזיס רקמות אחרי העובר. לכן, שיטת מסירה זו מספקת אסטרטגיה דרושה כעת לשליטה זמנית להערכה של תפקוד גן אחרי העובר.
Introduction
התחדשות של איברים ואיברים חשובה ביסודו להישרדות ולכושר; עם זאת, כמה בעלי חוליות, כולל אדם יש יכולת מוגבלת רגנרטיבית. בעוד כמה מודלים של בעלי החיים קיימים שיש להם יכולת התחדשות נרחבת, להפוך טכניקות גנטיות על מנת להעריך את תפקוד גן באיברים והתחדשות סרח יישאר מוגבל מאוד או לא קיימים. לכן, גישות חדשות נדרשות כדי לנתח את הביולוגיה המולקולרית של התחדשות באורגניזמים המודל הבאים.
דג הזברה היא מודל מבוסס היטב להבנת התא וביולוגיה מולקולרית של איבר ואיבר התחדשות 1, לא רק בגלל היכולת שלו המשמעותית להתחדש איברים מרובים, רקמות ואיברים, אלא גם משום שכמה קווי דגים מהונדסים קיימים כדי לעקוב אחר תאים ו לביטוי יתר גן בונה 2, 3. עם זאת, עיכוב גן בדג זברת זחל מוגבל בעיקר לoverexpression של מבנים דומיננטיים שליליים, שאינם זמינים לכל הגנים של עניין או transgene שהמוצר יכול לרכוש השפעות לזכות-of-פונקציה שאינו משקפות את פעילות אנדוגני של הגן. לפיכך, יש צורך בשיטה חלופית כדי להסיר ביטוי גנים ספציפי בנוקאאוט או מציאה כדי להתגבר על בעיות אלה.
גן ספציפי מיקוד באמצעות TALENS קיים כאמצעי גנטי הפוך למפסיד יוצא, תפקוד גן; עם זאת, אסטרטגית נוקאאוט הזה היא לעתים קרובות מאוד מוגבל להערכות תפקודיות בעובר מוקדם, כי דרישות ראשוניות של הגן למנוע התקדמות נוספת של התפתחות עוברית. לפיכך, חקר תופעות מאוחר יותר כגון התחדשות או הומאוסטזיס איברים לאחר פיתוח באמצעות TALENS מנועה 4, 5. לכן, יש צורך באסטרטגית הסרת גן חלופית, כי מטרות תפקוד גן אחרי התפתחות מוקדמת להעריך את הדרישות של גנים באיברים ומבנים שהוקמו באופן מלא. </p>
Morpholino הזרקה הוכח כיעילה במיקוד גנים בכמה איברים בוגרים והמבוגרים התחדשות 6-8 סנפיר, אך שיטות אלו דורשות electroporation ורבים איברים פנימיים קשים electroporate או בשל מיקומם או בשל רגישותם לחשמלית הפרעה. יתר על כן, כמה רקמות בזחל קשות להזריק ישירות, כי הזרקה ישירה עלולה לשבש את השלמות המבנית שלהם או בגלל הגודל שלהם הוא מגבילה. סנפיר הזנב של הזחל הוא מבנה אחד כזה, כי הזרקה ישירה לתוך finfold אינה אפשרית. לפיכך, חלופה לelectroporation והזרקה ישירה הייתה צורך למקד גנים ברקמות שגם הם קטנים מדי כדי להזריק או שלא ניתן electroporated.
על מנת למקד ומעכבים את הפונקציה של גנים ספציפיים במהלך ההתחדשות של סנפיר הזנב הזחל, יש לנו שונה בטכנולוגיות קיימות מאפשר morpholinossessment של תפקוד הגן במהלך רגנרציה של סנפיר הזנב בזחל מבוים המאוחר. שיטה זו מעסיקה משלוח תוך חדרי 9 של morpholinos העמסה-מתויג יחד עם מגיב transfection Endo-פורטר 10. פעם אחת בחדר, את תערובת morpholino-Endo-פורטר מתפשטת במהירות ברחבי הזחל דרך כלי הדם ונכנסה רקמות שהיו בלתי אפשרי בעבר להתמקד. שיטת הזרקה זו עשויה להיות שונה כדי למקד גנים ברקמות ספציפיות וייתכן בהחלט ניתן ליישם במודלים של בעלי חיים אחרים, כי כרגע אין לי שיטות גנטיות הפוכה כדי לעכב את תפקוד גן. לכן, היא מציעה שיטה מהירה וקלה עם הפוטנציאל לשימוש מגוון רחב ללמוד באופן מיידי את תפקוד גן במהלך הומאוסטזיס כללי איבר והתחדשות בשלבי זחל.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההזרקה תוך חדרי מספקת שיטת הערכה מהירה ואמינה לבדיקת תפקוד גן בשלבים מאוחר יותר של התפתחות או של הומאוסטזיס גוף מבלי להשפיע על תפקוד הגן בעובר. כדי להבטיח את ההצלחה של טכניקה זו, אחד צריכה להיות מודע לארבע נקודות קריטיות: 1) גודל מחט,) ייבוש 2 מ המחט, 3) צמצום נפח, ו4) זמן ח?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי (DFG), ברצוננו להודות Ayele Tsedeke Taddese לקבלת תמיכה טכנית.
Materials
| Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| Reagent/Material | |||
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information on www.genetools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information on www.genetools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricane (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSo4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Equipment | |||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming / Brown needle puller | Sutter | More information on www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
References
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. . Zebrafish: a practical approach. 261, 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D’Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
