Omvendt Genetisk Morpholino tilnærming ved hjelp av Cardiac Ventrikulær Injection å transfektere Flere Vanskelig-til-målet vev i sebrafisk Larva
Summary
En tilpasningsdyktig omvendt genetisk metode for sebrafisk for å vurdere gen-funksjon under senere stadier av utvikling og fysiologiske homeostase som vev regenerering bruke intraventrikulære injeksjoner av gen-spesifikke Morpholinos.
Abstract
Sebrafisk er en viktig modell for å forstå celle-og molekylærbiologi av orgel og vedheng regenerering. Men molekylære strategier for å ansette revers genetikk ennå ikke er tilstrekkelig utviklet for å vurdere gen-funksjon i regenerering eller vev homeostase under larvestadier etter sebrafisk embryogenese, og flere vev i sebrafisk larve er vanskelig å målrette. Intraventrikulære injeksjoner av gen-spesifikke Morpholinos tilbyr en alternativ metode for den aktuelle manglende evne til å genomically målrette sebrafisk gener i en tidsmessig styrt måte på disse stadier. Denne metode tillater fullstendig dispersjon og etterfølgende inkorporering av morpholino i forskjellige vev i hele kroppen, inkludert strukturer som tidligere var umulig å nå for eksempel de som er i larvehalefinnen, en struktur som ofte brukes for å undersøke ikke-invasivt regenerering av vev. Flere gener aktiveres under larve finfold regenerering blir også present ved regenerering av voksen virveldyr vev, slik at larven er en nyttig modell for å forstå regenerering hos voksne. Dette morfolinogruppe spredning metoden gir mulighet for rask og enkel identifisering av gener som kreves for regenerering av larve vev samt andre fysiologiske fenomener som regulerer vev homeostase etter embryogenesis. Derfor gir denne leveringsmetoden en dag nødvendig strategi for temporal kontroll til evalueringen av gen-funksjon etter embryogenesis.
Introduction
Regenerering av organer og lemmer er fundamentalt viktig for overlevelse og kondisjon; Imidlertid har flere virveldyr inkludert mennesket begrenset regenerative egenskaper. Mens flere dyremodeller eksisterer som har omfattende evne til reproduksjon, reversere genetiske teknikker for å vurdere gen-funksjon under orgel og vedheng regenerering er fortsatt svært begrenset eller ikke-eksisterende. Derfor er nye tilnærminger er nødvendig for å dissekere molekylærbiologi av regenerering i disse modellorganismer.
Sebrafisk er en godt etablert modell for å forstå cellen og molekylærbiologi av orgel og vedheng regenerering en, ikke bare på grunn av sin betydelige evne til å regenerere flere organer, vev og vedheng, men også fordi flere transgene fiskelinjer eksisterer for å spore celler og til økt ekspresjon av genet konstruerer to, tre. Det er imidlertid gene-hemming i larvesebrafisk hovedsakelig begrenset til overexpression av dominerende-negative konstruksjoner, som ikke er tilgjengelig for alle gener av interesse eller hvis transgenet produktet kan erverve gevinst-av-funksjon effekter som ikke gjenspeiler den endogene aktiviteten til genet. Således, er en alternativ metode til å spesifikt å fjerne gen-ekspresjon ved utstansing eller knockdown som trengs for å overkomme disse problemene.
Gene-spesifikk målgruppe ved hjelp Talens eksisterer som en omvendt genetiske midler til knockout gen-funksjon; Dette er imidlertid knockout strategi svært ofte begrenset til funksjonelle vurderinger under tidlig embryogenese, fordi innledende krav genet forhindre ytterligere progresjon av embryonal utvikling. Dermed studere senere fenomener som regenerering eller organ homeostase etter utvikling ved hjelp Talens er utelukket fire, fem. Derfor er en alternativ genet fjerning strategi nødvendig som er rettet mot gen-funksjon etter tidlig utvikling for å vurdere genet krav i fullt dannet organer og strukturer. </p>
Morfolino injeksjon har vist seg å være effektiv i målretting gener i noen få voksen organer og den voksne regenererende finnen 6-8, men disse fremgangsmåter krever elektroporering og mange indre organer er vanskelige å electroporate enten på grunn av deres plassering eller på grunn av deres følsomhet for elektriske avbrudd. Videre har en del vev i larven er vanskelige å injisere direkte, fordi direkte injeksjon kan forstyrre deres strukturelle integritet eller på grunn av sin størrelse er begrensende. Den halefinnen av larven er en slik struktur, for direkte injeksjon inn i finfold er ikke mulig. Det ble således oppnådd et alternativ til elektroporering og direkte injeksjon er nødvendig for å målrette gener i vev som enten er for små til å injisere eller ikke kan electroporated.
For å målrette og inhibere funksjonen av spesifikke gener i løpet av regenereringen av larvehalefinnen, har vi modifiserte eksisterende morfolino teknologier tillater enssessment av gen-funksjon under halefinnen regenerering i sen-iscenesatt larve. Denne metoden benytter intraventrikulært levering 9 av fluoriscerende-merket Morpholinos sammen med Endo-Porter transfeksjon reagens 10. En gang i ventrikkelen, sprer morfolino-Endo-Porter blandingen raskt gjennom larven via blodkar og går inn vev som tidligere har vært umulig å målrette. Denne injeksjonsmetoden kan modifiseres for å målrette gener i spesifikke vev, og muligens kan anvendes i andre dyremodeller som i dag mangler reverse genetiske metoder for å hemme genfunksjon. Dermed tilbyr en rask og enkel metode med potensial for bredt spekter bruk til umiddelbart studere gen-funksjon under generell organ homeostase og regenerering på larvestadiet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den intraventrikulært injeksjon gir en rask og pålitelig vurderingsmetode for testing gen-funksjon på senere stadier av utvikling eller kropps homeostase uten å påvirke genet funksjon under embryogenesis. For å sikre suksess for denne teknikken, bør man være oppmerksom på fire kritiske punkter: 1) p, 2) uttørking av nålen, 3) redusere volumet, og 4) minimal eksponering tid i sedasjon løsning. Nåler som er for liten vil tette ofte, mens nåler som er for store vil skade ventrikkel og føre til overdreven bl?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), ønsker vi å takke Ayele Tsedeke Taddese for teknisk support.
Materials
| Company | Catalog Number | Comments/Description | |
| Reagent/Material | |||
| Morpholino with 3´fluorescein tag | Gene Tools Inc. | Customized | More information on www.genetools.com |
| Endo-Porter | Gene Tools Inc. | More information on www.genetools.com | |
| Agarose | Serva | 120623 | For pouring plates to place the fish during injections and imaging |
| Tricane (L-Ethyl-m-amino-benzate-methane sulfonate) | Applichem | For anesthesia | |
| E3 medium (5 mM NaCl; 0.17 mM KCl; 0.33 mM CaCl2; 0.33 mM MgSo4) | For larval husbandry | ||
| Petri Dishes | Sarstedt | 821.472 | For placing the fish during injections and imaging |
| Equipment | |||
| Thin Wall Glass Capillaries | World Precision Instruments, Inc. | TW100F-3 | For preparing injection needles |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 5,242,956,003 | For loading the needle |
| Pasteur Pipettes (3 ml/1 ml) | Brand | 747760/ 74775 | For transfering larva |
| Flaming / Brown needle puller | Sutter | More information on www.sutter.com | |
| Watchmaker (Dumont) Tweezers (size 5) | World Precision Instruments, Inc. | 501985 | To brake the needle before sharpening |
| Dissecting microscope | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | Part of the whole injection setup |
| Fluorescence camera | Olympus, Leica, Zeiss | Varies with the manufacturer | To image the fluorescence after injeciton |
| PicoNozzle kit (microinjector holder) | World Precision Instruments | 5430-12 | For microinjections |
| Pneumatic PicoPump (microinjector) | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For microinjections |
References
- Gemberlin, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nature Protocols. 6, 2011 (1998).
- Skromne, I., Prince, V. E. Current perspectives in zebrafish reverse genetics: moving forward. Developmental Dynamics. 237, 861-882 (2008).
- Zu, Y., et al. TALEN-mediated precise genome modification by homologous recombination in zebrafish. Nature Protocols. 10, 329-332 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491, 114-118 (2012).
- Kizil, C., IItzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. , (2013).
- Hyde, D., Godwin, A., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. , (2012).
- Thummel, R., Bailey, T., Hyde, D. In vivo electroporation of morpholinos into the adult zebrafish retina. J Vis Exp. , (2011).
- Rieger, S., Kulkarni, R. P., Darcy, D., Fraser, S. E., Köster, R. W. Quantum dots are powerful multipurose vital labeling agents in zebrafish embryos. Developmental Dynamics. 234, 670-681 (2005).
- Madhavan, M., et al. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proceedings of the National Academy of Science U. 103, 14848-14853 (2006).
- Gilmour, D. T., Jessen, J. R., Lin, S. . Zebrafish: a practical approach. 261, 121-143 (2000).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135, 1735-1743 (2008).
- Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6, 69-77 (2009).
- Hyatt, T. M., Ekker, S. C. Vectors and techniques for ectopic gene expression in zebrafish. Methods Cell Biol. 59, 117-126 (1999).
- Hans, S., Kaslin, J., Freudenreich, D., Brand, M. Temporally controlled site-specific recombination in zebrafish. PLoS One. 4, (2009).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Liu, S., D, L. S. Zebrafish models for cancer. Annu. Re. Pathol. Mech. Dis. 6, 71-93 (2011).
- Stoick-Cooper, C. L., et al. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration. Development. 134, 479-489 (2007).
- Shen, S. P., Aleksic, J., Russell, S. Identifying targets of the Sox domain proteins Dichaete in the Drosophila CNS via targeted expression of dominant negative proteins. BMC Dev. Biol. 13, (2013).
- McNeish, J. D., Scott, W. J., Potter Jr, S. S. Legless, a novel mutation found in PHT1-1 transgenic mice. Science. 241, 837-839 (1988).
- Covarrubias, L., Nishida, Y., Terao, M., D’Eustachio, P., Mintz, B. Cellular DNA rearrangements and early developmental arrest caused by DNA insertion in transgenic mouse embryos. Mol. Cell. Biol. 7, 2243-2247 (1987).
