Estática Adesão Ensaio para o Estudo da integrina Ativação em Linfócitos T
Summary
Ensaio de adesão estático é uma ferramenta poderosa que pode ser utilizado para modelar as interacções entre linfócitos T e de outros tipos de células. Interacções são geradas por injecção de células T marcadas em poços revestidos com moléculas de adesão, enquanto que um leitor de placa é utilizada para quantificar o número de células aderentes a seguir lavagens em série.
Abstract
Adesão de linfócitos T é necessária para várias funções das células T, incluindo a migração para os locais de inflamação e formação de sinapses imunológicas com células apresentadoras de antigénios. As células T realizar adesão regulada através do controlo das propriedades adesivas de integrinas, uma classe de moléculas de adesão celular que consistem de pares heterodiméricas de proteínas transmembranares que interagem com moléculas-alvo de células parceiras ou matriz extracelular. O mais proeminente a integrina da célula T é a função dos linfócitos antigénio associado (LFA) -1, composta por subunidades aL e β2, cujo alvo é a molécula de adesão intracelular (ICAM) -1. A capacidade de uma célula T para controlar a aderência deriva da capacidade para regular os estados de afinidade de integrinas individuais. Sinalização dentro para fora descreve o processo pelo qual os sinais dentro de uma célula com que os domínios externos de integrinas para assumir um estado activado. Muito do nosso conhecimento destes fenómenos complexos é baseada na mecânicaEstudos realizados em simplificada em sistemas de modelo in vitro. O ensaio de adesão de linfócitos T descrito aqui é uma excelente ferramenta que permite que as células T para aderir a moléculas alvo, sob condições estáticas, e, em seguida, utiliza um leitor de placas fluorescente para quantificar a adesividade. Este ensaio tem sido útil na definição de substâncias de adesão-estimulador ou inibidor que actuam sobre os linfócitos, assim como a caracterização dos eventos de sinalização envolvidos. Embora descrito aqui para LFA-1 – ICAM-1 de adesão mediada; este ensaio pode ser facilmente adaptada para permitir o estudo de outras interacções adesivas (por exemplo, VLA-4 – fibronectina).
Introduction
Linfócitos T aderência é um processo fundamental para a resposta imune 1. É necessário para a interacção das células T com as células endoteliais decoração nas paredes dos capilares, para o antigénio de células apresentadoras de varrimento (APC) dentro de nódulos linfáticos, e para a formação de sinapses imunológicas (IS), com células-alvo 2. Estes requisitos são funcionalmente e cineticamente distintas. O processo de linfócitos extravasamento consiste quimioatração, rolamento, adesão firme e transmigração. A transição a partir de rolamento para firmar aderência requer as células T de responder a um sinal de receptor acoplado a proteína G rapidamente. Esta resposta produz uma interação ligante integrina que retarda e prisões da célula de rolamento 3. Uma mudança imediata na avidez integrina medeia este processo. A migração requer interacções betweenTcells dinâmicos e células endoteliais com a formação de aderências no 'front end "e quebra de aderências no' extremidade traseira 'com um intervalo de cerca de um minuto entre a formação e quebra 4. O IS constitui inminutes, mas precisa permanecer intacta por horas 6.
Curiosamente, uma molécula de adesão, a função de membro da família de linfócitos integrina antígeno associado (LFA) – 1, é essencial para todos estes processos 5. LFA-1 medeia a adesão através de interacções com vários membros da superfamília das imunoglobulinas. O ligando mais extensivamente estudado com a mais elevada afinidade para o LFA-1 é a molécula de adesão intercelular (ICAM) -1. Linfócitos circulantes não-activadas expressam baixa afinidade de LFA-1 na superfície das células, e, por conseguinte, não são capazes de aderir a superfícies revestidas de ICAM-1. LFA-1 é de afinidade variável e regulada por vários eventos de sinalização, tais como a proteína G acoplado a activação do receptor, estimulação de citoquinas, e os sinais mediados pelos receptores das células T (TCR). A forma de afinidade elevada, resultante da LFA-1 transmite activação intracelular para o espaço extracelular tinteracções hrough com ICAM-1. Este caminho é chamado de dentro para fora sinalização 7. Do mesmo modo, a sinalização através de LFA-1 a partir do espaço extracelular é chamado de fora para dentro de sinalização.
O cascatas de sinalização intracelular envolvidas na de dentro para fora e de fora para dentro de sinalização são um grande foco de pesquisa atual. A pequena GTPase Rap1 surgiu recentemente como o componente chave de dentro para fora sinalizando que é comum a ambos ligadura TCR e citocina sinalização 8. O papel crítico da Rap1 na activação de integrina é realçada pela descoberta de que a sobre-expressão de Rap1 estimula a adesão dependente de integrina de células T, enquanto que a adesão de células T é bloqueada através da expressão de Rap1 dominante negativa 9. Esses avanços em nossa compreensão da regulação integrina por Rap1 ter sido realizado utilizando em ferramentas vitro. Entre elas, está o ensaio de adesão estático descrito aqui.
O objetivo geral deste método é estudar Tadesividade de células a ICAM-1 as superfícies revestidas. Mais especificamente, é utilizado para medir e quantificar objectivamente LFA-1 de afinidade para com os seus ligandos de contador em células vivas em tempo real, sob diferentes condições. Esta técnica utiliza poços de poliestireno revestidas com ICAM-1, para imitar as superfícies celulares que as células T interagem com. Muitos ensaios de adesão de células T estático anteriormente descritos foram experimentalmente complexo. Estes ensaios frequentemente requeridos para as células T a ser marcado radioactivamente, utilizado células da córnea de bovino em cultura para criar uma matriz extracelular como o substrato para a aderência das células T, ou chamados para a estimulação não-fisiológico de células T durante um período prolongado para promover a adesão de células T 10. A utilização de medição fluorométrico para quantificar as células T após a incubação de adesão é um método mais sensível e precisa de quantificação, em comparação com a citometria de fluxo e microscopia, que são utilizados em muitos outros sistemas de ensaio 11. Além disso, uma única célula microscopic análise de integrina localização não permite a ampla, a análise da população com base na mesma maneira como a medição f luorométrica. Enquanto que os anticorpos específicos do Estado de LFA-1 de activação estão comercialmente disponíveis, estes anticorpos oferecer uma baixa sensibilidade em relação com o método descrito aqui. A principal vantagem sobre as técnicas alternativas é a sua simplicidade e a capacidade de analisar múltiplas condições experimentais simultaneamente. Ao considerar este método para uma aplicação específica, deve-se levar em conta que as células T devem ser selecionados de forma negativa, recentemente isolado, e marcadas com um marcador fluorescente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem diversos ensaios para estudar os sinais de LFA-1 a activação e a adesão de células T 12. A citometria de fluxo é utilizada para medir a LFA-1 estados de afinidade em células vivas, utilizando anticorpos monoclonais que se ligam selectivamente, quer dobrado ou estendido a LFA-1. Uma das limitações deste método é que ele não leva em conta a avidez dos integrinas. Ensaios de migração são ferramentas úteis, mas eles medem a migração, e não adesão desprezível em um ponto de tempo espec?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hirschil Trust, Michael Saperstein médicos Scholars Fundos de Pesquisa, ea comunhão NYU Whitehead apoiaram este trabalho.
Materials
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 mL centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
References
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