Статический Адгезия Анализ по изучению активации интегрина в Т-лимфоцитов
Summary
Статическое испытание адгезии является мощным инструментом, который может быть использован для моделирования взаимодействия между Т-лимфоцитов и других типов клеток. Взаимодействие генерируются путем инъекции меченых Т-клеток в лунках, покрытых молекул адгезии, в то время как планшет-ридера используется для количественной количество прилипших клеток после последовательных промывок.
Abstract
Т адгезии лимфоцитов требуется для множества функций Т-клеток, в том числе перехода на участках воспаления и формирования иммунологических синапсов с антиген представляющих клеток. Т-клетки достижения регулируемой адгезию, контролируя адгезионные свойства интегринов, класса молекул клеточной адгезии, состоящих из гетеродимерных пар трансмембранных белков, которые взаимодействуют с молекулами-мишенями на клетках-партнеров или внеклеточного матрикса. Наиболее ярким Т-клеток интегрину является функция лимфоцитов антиген (МАФ) -1, состоящий из субъединиц αL и β2, чья цель внутриклеточный молекулы адгезии (ICAM) -1. Способность Т-клетке контролировать адгезию происходит от способности регулировать аффинных состояния отдельных интегринов. Наизнанку сигнализации описывает процесс, при котором сигналы внутри клетки вызвать внешние домены интегринам предположить активированном состоянии. Большая часть наших знаний этих сложных явлений основана на механистическойисследования, проведенные в упрощенном в пробирке модельных системах. Т-лимфоцит адгезия анализа, описанного здесь является отличным инструментом, который позволяет Т-клетки придерживаться с молекулами-мишенями, в статических условиях, а затем использует флуоресцентный планшет-ридера для количественного адгезивностью. Этот анализ был полезен при определении стимулирующих адгезию или ингибирующее вещества, которые действуют на лимфоцитах, а также характеризующие сигнальных событий, связанных. Хотя изобретение описано здесь на LFA-1 – ICAM-1 адгезии, опосредованной; Этот анализ может быть легко приспособлены для обеспечения изучении других адгезивных взаимодействий (например, VLA-4 – фибронектина).
Introduction
Т адгезии лимфоцитов является фундаментальным процессом в иммунном ответе 1. Он необходим для T взаимодействия клеток с эндотелиальные клетки украшать стенки капилляров, для сканирования антиген представляющих клеток (АРС) в лимфатические узлы, и для формирования иммунологических синапсов (IS) с клетками-мишенями 2. Эти требования являются функционально и кинетически различны. Процесс лимфоцитов экстравазационным состоит из хемоаттракции, прокат, фирмы адгезии и переселения. Переход от подвижного фирме адгезии требуется Т-клеток реагировать на G-белком сигнала рецепторов быстро. Этот ответ дает интегрину взаимодействие лиганда, который замедляет и аресты качению ячейку 3. Немедленное изменение интегринового жадностью посредником этот процесс. Миграция требует динамического взаимодействия betweenTcells и эндотелиальные клетки с образованием спаек в «переднем конце» и поломки спаек в "задней части"с интервалом около минуты между формирования и разрушения 4. ЕСТЬ формирует inminutes, но должен оставаться нетронутым в течение нескольких часов 6.
Интересно, что одна молекула адгезии, интегрин семья функция-член лимфоцитов антиген (МАФ) – 1, имеет важное значение для всех этих процессов 5. LFA-1 опосредует адгезию через взаимодействие с несколькими членами надсемейства иммуноглобулинов. Наиболее широко изучены лиганд с наибольшим сродством к LFA-1 межклеточной адгезии (ICAM) -1. Неактивированного циркулирующие лимфоциты экспрессируют низкое сродство LFA-1 на поверхности клеток и, следовательно, не могут придерживаться ICAM-1 покрытием поверхности. LFA-1 сродство является переменной и регулируется несколькими сигнальных событий, таких как G активации белком рецептор цитокина, стимуляции и сигналов, опосредуемых Т-клеточных рецепторов (TCR). Полученную высокое сродство форма LFA-1 передает внутриклеточный активации во внеклеточное пространство твозь взаимодействия с ICAM-1. Этот путь называется наизнанку сигнализации 7. Кроме того, передачи сигналов через LFA-1 из внеклеточного пространства называется снаружи внутрь сигнализации.
Внутриклеточный каскады, участвующих в наизнанку и за ее пределами в сигнализации сигнализации являются одним из основных направлений современных исследований. Небольшой ГТФ Rap1 недавно стала ключевой составляющей наизнанку понять, что является общим как для TCR перевязки и цитокина сигнализации 8. Решающая роль Rap1 в активации интегринового выделен в связи с открытием, что избыточная экспрессия Rap1 стимулирует интегринзависимой адгезию Т-клеток, в то время как Т клеточной адгезии заблокирован выражения доминантной негативной Rap1 9. Эти достижения в нашем понимании интегринового регулирования Rap1 были совершены с использованием в инструментах пробирке. Среди них статический адгезия анализа, описанного здесь.
Общая цель этого метода состоит в изучении Tклеток адгезия к ICAM-1 поверхностей, покрытых. Более конкретно, оно используется для объективно оценивать количественно и LFA-1 сродство к его счетчик лигандов в живых клетках в реальном времени, при разных условиях. Этот метод использует полистирола лунки, покрытые ICAM-1, чтобы имитировать клеточные поверхности, что Т-клетки взаимодействуют с. Многие описанные ранее адгезии статическая Т-клеток анализы были экспериментально комплекс. Эти анализы часто требуется для Т-клеток, которые будут радиоактивно метили, используемые культивируемые клетки роговицы крупного рогатого скота, чтобы создать внеклеточный матрикс в качестве субстрата для T клеточной адгезии, или называют для не-физиологической стимуляции Т-клеток в течение длительного срока, чтобы способствовать T клеточную адгезию 10. Использование флуорометрического измерения для количественной оценки Т-клеток после инкубации адгезии является более чувствительным и точным методом количественного по сравнению с проточной цитометрии и микроскопии, как используются во многих других системах анализа 11. Кроме того, один Микроскоп клетокИК анализ локализации интегрина не допускает широкий, населения на основе анализа так же, как флуорометрического измерения. Хотя активации специфичные для состояния LFA-1 антитела являются коммерчески доступными, эти антитела предложить низкую чувствительность по отношению к способу, описанному здесь. Основное преимущество над альтернативными методами является его простота и способность исследовать различные экспериментальные условия одновременно. При рассмотрении этого метода для конкретного приложения, следует принять во внимание, что Т-клетки должны быть негативно выбран, свежевыделенные, и помечены с флуоресцентным маркером.
Protocol
Representative Results
Discussion
Есть несколько анализов для изучения сигналы LFA-1 и Т активации клеточной адгезии 12. Проточная цитометрия используется для измерения LFA-1 сродством состояния в живых клеток с использованием моноклональных антител, которые связываются избирательно либо согнут или расширенный LFA-1. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hirschil Доверие, Майкл Саперштейн ученых-медиков исследовательские фонды, и общение NYU Уайтхед поддержала эту работу.
Materials
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 mL centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
References
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Dustin, M. L. Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses. Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).
- Springer, T. A., Dustin, M. L. Integrin inside-out signaling and the immunological synapse. Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).
- Mor, A., et al. D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane. Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).
- Bivona, T. G., et al. Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion. J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Bhattacharyya, S. P., et al. Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells. Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
