共焦点顕微鏡による絶縁型肺胞マクロファージの抗真菌活性を評価する
Summary
共焦点顕微鏡によって貪食されたアスペルギルス胞子の成長を制御するために単離したマウス肺胞マクロファージの能力を評価する方法。
Abstract
肺は、宿主細胞は日常的に微生物および微生物産物に曝露されるインターフェースである。肺胞マクロファージは、吸入真菌および他の微生物が発生した最初の行の貪食細胞である。マクロファージおよび他の免疫細胞が病原体認識受容体によってアスペルギルスモチーフを認識し、下流の炎症反応を開始する。食細胞NADPHオキシダーゼは、活性酸素中間体（ROIを）を生成し、宿主防御のために重要である。 NADPHオキシダーゼが重要ではあるが、好中球媒介宿主防御のための1から3は 、マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの重要性は十分に定義されていない。本研究の目的は、A.に対する宿主防御を仲介するマクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの特定の役割を描写することであったフミ 。私たちは、肺胞マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼが貪食Aの成長を制御していることがわかっフミは 4胞子。ここでは、マウスαの能力を評価するための方法を記載貪食アスペルギルス胞子 （分生子）の成長を制御するためlveolarマクロファージ（AM）。肺胞マクロファージは、 インビボで染色し、10日後に気管支肺胞洗浄（BAL）マウスから単離される。マクロファージは、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するA.を播種し、次いで、カバーガラス上に播種するフミ胞子 。特定の時間に、細胞を固定し、貪食された胞子を有する無傷マクロファージの数を、共焦点顕微鏡法によって評価される。
Introduction
肺胞マクロファージは、吸入微生物が発生した最初の行の貪食細胞である。マクロファージは、病原体認識受容体によってアスペルギルスモチーフを認識し摂取および吸入胞子（分生子）の成長を制限し、炎症反応を開始する。食細胞NADPHオキシダーゼは、スーパーオキシドアニオンおよび下流の活性酸素中間体（ROIを）への分子状酸素に変換します。慢性肉芽腫症（CGD）は、重度の細菌および真菌感染により、過度の炎症反応によって特徴づけられるNADPHオキシダーゼの遺伝性疾患である。
NADPHオキシダーゼが重要ではあるが、好中球媒介宿主防御のための1から3は 、マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの重要性は十分に定義されていない。以前の研究では好中球が主に菌糸のステージ5をターゲットに対し、肺胞マクロファージは、 アスペルギルス胞子を摂取し、殺すことが示されている。しかし、矛盾するresulがあったA.の成長を制御するマクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの役割としてのts フミ胞子 6、7。
このメソッドの目的は、A.に対する宿主防御を仲介するマクロファージにおけるNADPHオキシダーゼの特定の役割を描写することであったフミ胞子 。私たちは、肺胞マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼが貪食Aの成長を制御していることがわかっフミは 4胞子。最も密接に吸入菌類に対する宿主応答をモデル化するために、我々はすぐに犠牲を次の刺激されていないマウスから気管支肺胞洗浄により収穫肺胞マクロファージを使用していました。孤立した肺胞マクロファージの使用は、生体内でのアスペルギルスに対する防御他の免疫細胞（ 例えば 、好中球を募集）が存在しない場合に、その抗真菌活性に焦点を当てることができました。この方法では、肺胞マクロファージは、収穫後の操作の量を最小にするように収穫する前にインビボで染色した。</ pの>
この議定書のもう一つの利点は、GFPを発現するAの使用でフミ株 。この菌は菌糸のステージを通じて生子段階からのGFPを発現し、さらに染色の必要がありません。さらに詳細な画像を得るために、我々は得られた画像から3次元構造の再構築を可能にし、共焦点顕微鏡を選びました。三次元再構成は、菌糸がマクロファージやを通じて周囲に成長しているのではなく、区別できるようになります。分生子はまた、細胞外に対する細胞内のように正確に区別することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
一緒にin vivoで真菌のチャレンジでマクロファージの抗真菌活性のex vivo分析のためにこのアプローチを使用して、我々は以前に、マクロファージにおけるNADPHオキシダーゼはA.に対する防御において重要な役割を果たしていることが実証されフミ4。孤立した肺胞マクロファージの使用は、生体内でのアスペルギルスに対する防御他の免疫細胞（ 例?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ロズウェルパークがん研究所に研究所アレルギー感染症のグラントR01AI079253（BHS）は、国立がん研究所がんセンターによる支援助成CA016056によってサポートされていました。
Materials
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Used to make AvertinAnesthetic |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma | A-1685 | Used to make AvertinAnesthetic |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| NH4CL | Sigma | A0171 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| KHCO3 | Sigma | P91444 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| EDTA | Sigma | E6758 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| 22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter | BD | 381523 | Insyte Autoguard Winged |
| insulin syringes | |||
| 6 ml syringes | |||
| 4-way stopcock | Fisher Scientific | 50-700-077 | |
| suture thread | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes | |||
| gauze sponges (4 inch square) | |||
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | heat inactivated |
| Hema 3 Stain Set | Fisher Scientific | 22-122-911 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | |
| Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants | BD | 297252 | |
| Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein | provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada | ||
| 100 micron Cell Strainers | BD Falcon | 64753-00 | |
| scissors | |||
| forceps | |||
| Biological Safety Cabinet Class II | |||
| Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor | |||
| Leica DM1000 light microscope | |||
| Hemocytometer | |||
| Cytospin 2 centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Cell Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| 22X22 mm micro cover glass | VWR | 48366-227 | glass coverslips |
| 6 well Cell Culture Plates | Corning | 3506 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-1LP | |
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Leica TCS SP2 system with a laser point scanner | Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope |
References
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