بروتوكول لتشكيل بيوفيلم الملون في جهاز ميكروفلويديك مع مايكرو الأركان
Summary
Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.
Abstract
العديد من الأنواع البكتيرية تمتلك القدرة على نعلق على الأسطح واستعمار لهم في شكل أغشية رقيقة تدعى الأغشية الحيوية. الأغشية الحيوية التي تنمو في وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها هي ذات الصلة إلى العديد من العمليات الصناعية والبيئية مثل معالجة مياه الصرف الصحي وCO 2 عزل. كنا الزائفة المتألقة، بكتيريا الهوائية سلبية الغرام، للتحقيق في تشكيل بيوفيلم في جهاز ميكروفلويديك أن يقلد وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها. يتكون الجهاز ميكروفلويديك من مجموعة من المشاركات الصغرى، والتي كانت ملفقة باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة. بعد ذلك، تم تشكيل بيوفيلم التحقيق في هذه الأجهزة مع تدفق ونظهر تشكيل الأغشية الحيوية الخيطية المعروفة باسم اللافتات في الجهاز لدينا. وتقدم بروتوكولات مفصلة لتصنيع وتجميع الأجهزة ميكروفلويديك هنا جنبا إلى جنب مع بروتوكولات ثقافة البكتيرية. وتعرض أيضا إجراءات تفصيلية للتجريب مع الجهاز ميكروفلويديك جنبا إلى جنب مع ممثلالنتائج.
Introduction
في الآونة الأخيرة، أثبتنا البكتيرية ديناميات تشكيل بيوفيلم في جهاز ميكروفلويديك الذي يحاكي وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها 1. الأغشية الحيوية البكتيرية هي أساسا مستعمرات البكتيريا السطحية التي يتم تجميعها من المواد البوليمرية المغطى خارج الخلية (EPS) 2-4. يمكن لهذه الأفلام رقيقة من البكتيريا تشكل تقريبا في كل كوة يمكن تصورها تتراوح بين الأسطح الملساء إلى موطن أكثر تعقيدا من وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها. Valiei وآخرون. 1 تستخدم جهاز ميكروفلويديك مع مجموعة من الأعمدة الصغيرة لمحاكاة هيكل وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها ودرس تشكيل بيوفيلم في هذا الجهاز بوصفها وظيفة من معدل تدفق السوائل. ووجد الباحثون أنه في نظام تدفق معين، بدأت الأغشية الحيوية الخيطية المعروفة باسم اللافتات في الظهور بين ركائز مختلفة. يمكن المربوطة اللافتات في واحد أو كلا الطرفين على الأسطح الصلبة، ولكن تم تعليق بقية هيكل في السائل. يبدأ تشكيل غاسل عادة بعد طبقة الأولى من بيوفيلم شكلت وشكلهأيون يمكن أن تملي التطور الطويل الأمد للبيوفيلم في مثل هذه الموائل المعقدة. في الآونة الأخيرة، حققت العديد من الباحثين ديناميات تشكيل غاسل. أظهرت يزدي وآخرون. 5 أن اللافتات التي يمكن أن تشكل في دوامة التدفقات القادمة من فقاعة تتأرجح. في تجربة أخرى، حققت رسكوني وآخرون. 6 تأثير قناة انحناء والهندسة القناة على تشكيل اللافتات. ووجد الباحثون أن اللافتات التي يمكن أن تشكل في الفروع المنحنية من microchannels، ويرتبط غاسل التشكل إلى الحركة. وقد أثبتت الأبحاث الحديثة أن اللافتات التي يمكن أن يكون لها تداعيات واسعة في مختلف السيناريوهات الطبيعية والاصطناعية لأنها يمكن أن تكون بمثابة السلائف إلى تشكيل الهياكل الناضجة في واجهات مسامية، يؤدي إلى انتشار بيوفيلم السريع والكارثي في النظم الطبية الحيوية، وأيضا أن يسبب flow- كبيرة التفاعلات هيكل، الخ 1،7-9.
اللافتات بيوفيلم غالبا ما تشكل طالموائل ن معقدة مثل وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها. فهم نمو بيوفيلم في بيئة وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها وثيق الصلة إلى العديد من العمليات البيئية والصناعية مثل معالجة مياه الصرف الصحي البيولوجية 10، الحفاظ جيدا تتحمل النزاهة في حالات مثل CO 2 القبض على 11 ويسد المسام في التربة 12. يمكن مراقبة تشكيل بيوفيلم في مثل هذه الموائل المعقدة غالبا ما تكون صعبة نظرا لغموض وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها. في مثل هذه الحالات، يمكن أن تستند على microfluidics المنابر الإعلامية التي يسهل اختراقها يثبت مفيد للغاية لأنها تسمح في الوقت الحقيقي والرصد في الموقع. ميزة أخرى من على microfluidics هو القدرة على بناء المفاعلات الحيوية متعددة على منصة الحيوية ميكروفلويديك واحدة في وقت واحد والسماح للرصد و / أو دمج أجهزة الاستشعار على الانترنت. المرونة اللازمة لتنفيذ التجارب المعملية متعددة في جهاز واحد، والقدرة على جمع البيانات الهامة ذات الصلة لأغراض التحليل الإحصائي الدقيق هو المهم متقدمantage نظم ميكروفلويديك 13،14.
في سياق المناقشة الواردة أعلاه، فإن فهم ديناميات تشكيل غاسل في بيئة وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها يكون مفيدا للعديد من التطبيقات. في هذه الدراسة، ونحن نطور بروتوكول للتحقيق في تشكيل غاسل في الجهاز الذي يحاكي وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها. تصنيع منصة ميكروفلويديك، يتم وصف الخطوات اللازمة لزراعة الخلايا والتجريب. في تجاربنا، كان يعمل النوع البري سلالة بكتيرية من المتألقة الزائفة. P. المتألقة، وجدت بشكل طبيعي في التربة، ويلعب دورا رئيسيا في الحفاظ على البيئة التربة 15. ان سلالة البكتيرية المستخدمة تم راثيا للتعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) جوهري.
Protocol
Representative Results
Discussion
أثبتنا جهاز ميكروفلويديك البسيط الذي يحاكي وسائل الإعلام التي يسهل اختراقها لدراسة تطوير بيوفيلم في الموائل المعقدة. هناك العديد من الخطوات الهامة التي تملي نتائج التجارب. وتشمل هندسة الجهاز. في حين أن هندسة آخر يمكن أن تختلف وكاف مسام الفضاء لافتات لتشكيل ضروري. وع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri-dish | Fisher | 875712 | sterile 100mmx15mm polystyrene petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24incubator shaker series | |
| 50 mL sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene Rnase-/Dnase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 ug/mL |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole- Parmer |
References
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. All together now: Integrating biofilm research across disciplines. MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).
- Yazdi, S., Ardekani, A. M. Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow. Biomicrofluidics. 6, 044114 (2012).
- Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers. J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).
- Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems. P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).
- Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems. Biofouling. 28, 551-562 (2012).
- Taherzadeh, D., et al. Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows. Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).
- Vrouwenvelder, J. S., et al. Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems. Water Res. 44, 689-702 (2010).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. Modeling of biological clogging in unsaturated porous media. J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).
- Neethirajan, S., et al., Bhushan, B., et al. . Encylopedia of Nanotechnology. , (2012).
- Barathi, S., Vasudevan, N. Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil. Environ Int. 26, 413-416 (2001).
- Das, S., Kumar, A. Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets. arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Phys Rev Lett. 93, (2004).
- Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications. Lab Chip. 8, 689-693 (2008).
