Protocol voor Biofilm Streamer Vorming in een microfluïdische apparaat met micro-pijlers
Summary
Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.
Abstract
Verschillende bacteriële species bezitten het vermogen om te hechten aan oppervlakken en koloniseren ze in de vorm van dunne films genaamd biofilms. Biofilms die groeien in poreuze media zijn voor verschillende industriële en ecologische processen, zoals de behandeling van afvalwater en CO2 vastlegging relevant. We gebruikten Pseudomonas fluorescens, een Gram-negatieve aërobe bacterie, om biofilmvorming in een microfluïdische apparaat dat werkt poreuze media onderzoeken. De microfluïdische inrichting bestaat uit een array van micro-posten, die zijn vervaardigd met behulp van zachte lithografie. Vervolgens biofilmvorming in deze apparaten met stroom werd onderzocht en we tonen de vorming van biofilms draadvormige bekend als streamers in ons apparaat. De gedetailleerde protocollen voor de fabricage en assemblage van microfluïdische apparaat worden hier voorzien, samen met de bacteriecultuur protocollen. Gedetailleerde procedures voor experimenten met de microfluïdische apparaat worden ook gepresenteerd samen met de representatieveresultaten.
Introduction
Onlangs toonden we aan bacteriële biofilmvorming dynamiek in een microfluïdische apparaat dat poreuze media 1 nabootst. Bacteriële biofilms zijn in wezen kolonies van oppervlakte geaggregeerd bacteriën die worden omhuld door extracellulaire polymere stoffen (EPS) 2-4. Deze dunne films bacteriën kan vormen in bijna elke denkbare niche variërend van gladde oppervlakken de veel complexere habitat poreuze media. Valiei et al. 1 gebruikte een microfluïdische inrichting met een reeks micro-pijlers te simuleren een poreuze media structuur en bestudeerd biofilmvorming in deze inrichting als functie van de stroomsnelheid. Zij vonden dat in een bepaalde flow regime, draadvormige biofilms bekend als streamers begon te ontstaan tussen de verschillende pijlers. Wimpels kan worden vastgebonden op een of beide uiteinden aan vaste oppervlakken, maar de rest van de structuur wordt gesuspendeerd in vloeistof. Streamer vorming begint meestal na een eerste laag van biofilm heeft gevormd en het formaation kan de evolutie van biofilm langdurige dicteren dergelijke complexe habitats. Onlangs hebben een aantal onderzoekers de dynamiek van de streamer vorming onderzocht. Yazdi e.a.. 5 bleek dat de streamers in wervelende stromen afkomstig van een oscillerende luchtbel kan vormen. In een ander experiment, Rusconi e.a.. 6 onderzochten het effect van het kanaal kromming en geometrie kanaal op de vorming van streamers. Zij vonden dat de streamers in gebogen secties microkanalen kunnen vormen en streamer morfologie heeft betrekking op motiliteit. Recent onderzoek heeft aangetoond dat streamers brede vertakkingen in verschillende natuurlijke en kunstmatige scenario's kunnen hebben als ze kunnen fungeren als voorlopers van de vorming van volwassen structuren in poreuze interfaces, leiden tot een snelle en katastrofisch biofilm proliferatie in een biomedische systemen, en ook aanzienlijke flow veroorzaken structuur interactions, etc 1,7-9.
Biofilm streamers vormen i vaakn complexe habitats zoals poreuze media. Inzicht biofilmgroei in poreuze media omgeving is verschillende ecologische en industriële processen relevante zoals biologische afvalwaterzuivering 10, onderhouden goed boring integriteit in situaties zoals CO2 afvang 11 en verstopping van poriën in de bodem 12. Waarnemen biofilmvorming in dergelijke complexe habitats vaak moeilijk als gevolg van de ondoorzichtigheid van poreuze media. In dergelijke situaties kan microfluidics gebaseerd poreuze media platforms blijken uiterst voordelig als zij toestaan dat real-time en in situ monitoring. Een ander voordeel van microfluïdische is de mogelijkheid om meerdere bioreactoren bouwen op een bio-microfluidic platform en tegelijkertijd zorgen voor online monitoring en / of opname van sensoren. De flexibiliteit meerdere laboratoriumexperimenten uitvoeren in een apparaat en het vermogen om significante relevante gegevens te verzamelen voor nauwkeurige statistische analyse is een belangrijke bijwoordantage van microfluïdische systemen 13,14.
In de context van de bovenstaande discussie, zou begrijpen streamer vorming dynamiek in een poreuze media milieu gunstig verscheidene toepassingen. In deze studie hebben we de ontwikkeling van het protocol voor het onderzoek streamer vorming in een apparaat dat bootst poreuze media. Fabricage van de microfluïdische platform nodige maatregelen voor celcultuur en experimenten beschreven. In onze experimenten werd de wildtype bacteriële stam van Pseudomonas fluorescens P. toegepast. fluorescens, nature in de bodem, speelt een belangrijke rol bij het handhaven bodemecologie 15. De bacteriestam werkzaam waren genetisch gemanipuleerd groen fluorescent eiwit (GFP) constitutief.
Protocol
Representative Results
Discussion
We hebben laten zien een eenvoudige microfluïdische apparaat dat poreuze media nabootst voor het bestuderen van biofilm ontwikkeling in complexe habitats. Er zijn verschillende belangrijke stappen die de uitkomst van de experimenten bepalen. Zij omvatten geometrie apparaat. Terwijl de paal geometrie kan variëren, voldoende porie-ruimte voor streamers te vormen noodzakelijk. Bovendien Valiei et al. 1 hebben aangetoond dat streamer vorming treedt alleen in bepaalde Luchtdebiet. Bij een flow lager dan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri-dish | Fisher | 875712 | sterile 100mmx15mm polystyrene petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24incubator shaker series | |
| 50 mL sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene Rnase-/Dnase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 ug/mL |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole- Parmer |
References
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. All together now: Integrating biofilm research across disciplines. MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).
- Yazdi, S., Ardekani, A. M. Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow. Biomicrofluidics. 6, 044114 (2012).
- Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers. J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).
- Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems. P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).
- Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems. Biofouling. 28, 551-562 (2012).
- Taherzadeh, D., et al. Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows. Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).
- Vrouwenvelder, J. S., et al. Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems. Water Res. 44, 689-702 (2010).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. Modeling of biological clogging in unsaturated porous media. J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).
- Neethirajan, S., et al., Bhushan, B., et al. . Encylopedia of Nanotechnology. , (2012).
- Barathi, S., Vasudevan, N. Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil. Environ Int. 26, 413-416 (2001).
- Das, S., Kumar, A. Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets. arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Phys Rev Lett. 93, (2004).
- Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications. Lab Chip. 8, 689-693 (2008).
