マイクロピラーとマイクロ流体デバイス内のバイオフィルムストリーマ形成のためのプロトコル
Summary
Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.
Abstract
いくつかの細菌種は、表面に付着したバイオフィルムと呼ばれる薄膜の形態でそれらにコロニーを形成する能力を有する。多孔質媒体で成長バイオフィルムは、このような廃水処理およびCO 2の隔離など、いくつかの産業や環境のプロセスに関連している。私たちは、多孔質媒体を模倣マイクロ流体デバイス内のバイオフィルム形成を調査するために、 シュードモナス·フルオレッグラム陰性好気性細菌を使用していました。マイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィを用いて作製されたマイクロポストのアレイからなる。続いて、流れにこれらのデバイスにおけるバイオフィルムの形成を検討したと私たちは私たちのデバイス内のストリーマとして知られている糸状バイオフィルムの形成を実証する。マイクロ流体デバイスの製造および組立のための詳細なプロトコルは、細菌培養プロトコールと一緒にここに提供されています。マイクロ流体デバイスを用いた実験のための詳細な手順も、代表と一緒に提示されている結果。
Introduction
最近では、多孔質媒体1を模したマイクロ流体デバイス内の細菌のバイオフィルム形成のダイナミクスを示した。細菌性バイオフィルムは、本質的に、細胞外高分子物質（EPS）2-4によって包まれている表面に凝集する細菌のコロニーである。細菌のこれらの薄膜は、滑らかな表面から多孔質媒体のはるかに複雑な生息地に至るまで、ほぼすべての考えられるニッチを内形成することができる。 Valiei ら 1は多孔質媒体の構造をシミュレートするために、マイクロピラーのアレイを有するマイクロ流体デバイスを使用し、流体の流量の関数として、この装置ではバイオフィルム形成を研究した。彼らはある特定の流れ状態で、ストリーマとして知られている糸状バイオフィルムを別の柱の間に現れ始めたことがわかった。ストリーマは、一方に係留され得るか、または両方が、固体表面に終了するが、その他の構成は、液体中に懸濁されている。ストリーマの形成は、典型的には、バイオフィルムの初期層を形成した後に開始し、そのフォーマットイオンは、このような複雑な生息地でバイオフィルムの長期的な発展を決定することができます。最近、いくつかの研究者は、ストリーマ形成のダイナミクスを調べた。ヤズディら 5はストリーマが発振バブルから生じる渦流れに形成することができることを示した。別の実験では、Rusconiからら 6は、ストリーマの形成にチャネル曲率およびチャネルの形状の影響を調べた。彼らは、ストリーマは、マイクロチャネルの湾曲部分に形成できることを見出し、ストリーマ形態は、運動性に関連する。最近の研究では、ストリーマは、彼らが多孔インタフェースで成熟した構造の形成の前駆体として働くことができるように、さまざまな天然および人工のシナリオで幅広い影響を持つ生物医学システムで迅速かつ壊滅的なバイオフィルムの増殖につながり、また、実質的なフロースルーを引き起こす可能性があることを実証した構造の相互作用など 1,7-9。
バイオフィルム吹流しは、多くの場合、私を形成するそのような多孔質媒体としてのn複雑な生息地。多孔質のメディア環境におけるバイオフィルムの成長を理解することは、例えばCO 2回収11、土壌12中の細孔の閉塞のような状況ではよく穴の整合性を維持、このような生物学的廃水処理10などのいくつかの環境および産業プロセスに関連しています。このような複雑な生息地でのバイオフィルム形成を観察することにより、しばしば多孔質媒体の不透明度に挑戦することができます。それらはリアルタイムで可能にし、 その場での監視にこのような状況では、マイクロ流体ベースの多孔質媒体プラットフォームは、非常に有利で 証明することができる。マイクロフルイディクスのもう一つの利点は、単一のバイオマイクロ流体プラットフォーム上で複数のバイオリアクターを構築し、同時にオンライン監視および/またはセンサの組み込みを可能にする機能です。一つの装置で正確な統計分析のために有意な関連データを収集する機能で複数の研究室での実験を実施するための柔軟性が重要である前売りマイクロ流体システム13,14のアンテージ。
上記の議論の文脈では、多孔質媒体環境でストリーマ形成の動態を理解することは、複数のアプリケーションに有益であろう。本研究では、多孔質媒体を模倣装置におけるストリーマの形成を調査するためのプロトコルを開発しています。マイクロフルイディックプラットホームの製造は、細胞培養実験のために必要な手順が記載されている。実験では、 シュードモナス·フルオレッセンスの野生型細菌株を用いた。P.土壌中に天然に見出さフルオレッセンスは、土壌の生態15を維持する上で重要な役割を果たしている。用いられる細菌株は、遺伝的に恒常的に緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するように操作されていた。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちは、複雑な生息地でバイオフィルムの発達を研究するための多孔質媒体を模倣シンプルなマイクロ流体デバイスを実証した。実験の結果を決定するいくつかの重要なステップがあります。彼らは、デバイスのジオメトリが含まれています。ポスト形状が変化することができますが、フォームにストリーマに十分な細孔空間が必要である。また、Valiei ら 1はストリーマの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri-dish | Fisher | 875712 | sterile 100mmx15mm polystyrene petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24incubator shaker series | |
| 50 mL sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene Rnase-/Dnase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 ug/mL |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole- Parmer |
References
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