バレット食道の細胞の特徴のための免疫蛍光法
Summary
バレット食道の分子ドライバーを改良し、情報のための識別可能な必要性がある。免疫蛍光染色は、細胞形態学上の細胞シグナル伝達の効果を理解するために有用な技術である。私たちは、バレット食道細胞において治療上の処置を評価するための免疫蛍光染色を使用するためのシンプルで効果的なプロトコルを提示する。
Abstract
食道腺癌（EAC）は、全生存期間の17％未満の割合とEACの発生率は過去20年間に劇的に上昇しているがあります。 EACの主要な危険因子の一つは、バレット食道（BE）、慢性の胸焼けに応答して正常食道扁平上皮化生の変化である。 EACとBE、EAC者になるの進行に関与する分子事象、特に変更されたシグナル伝達経路の尋問の間に十分に確立された接続にもかかわらず、ほとんどわかっていない。これの多くは、これらの疾患を研究するために利用できるin vitroモデルにおいて適切性の欠如に起因している。最近では、不死化細胞株BEは、BEのインビトロ研究を可能にする商業的に利用可能になっている。ここでは、治療用化合物への曝露後の細胞シグナル伝達および構造体のインビトロ特徴付けを可能に 、BE不死化細胞株の免疫蛍光染色のための方法を提示する。これらの技術の適用は、HELうpはEACの進行者になるに関与するメカニズムへの洞察を開発し、EACの治療および予防のための潜在的な道を提供する。
Introduction
バレット食道（BE）は、食道の正常扁平上皮および胃食道逆流症（GERD）1から生じる胃内容への慢性暴露の結果での化生変化です。 BEは、GERDへの反応に対する防御機構であると考えられているがBEの存在は、食道腺癌（EAC）、有意に低い生存率1を搬送する疾患のリスクの増加を与える。現在の推定は、米国人口の5.6％がBEていることを示唆しているBEは、しばしば無症候性であるように、しかしながら、それはBEの大部分は2診断未確定のままであると考えられる。逆流性食道炎とEACの両方の発生率は、継続的な成長3を見てきたように、この情報が潜在的にEACにBEの進行を防止に向けた治療的アプローチを提供することが特に、EACにBEの進行に関与する分子メカニズムを理解することが重要になってきている。
<p class="jove_content">患者向けの研究は、BE-EACの病因1の現在のパラダイムをもたらした。慢性炎症、外傷、および胃内容物への長期暴露に起因する遺伝毒性損傷はEACに腫瘍の進行を促進BE病変に対する選択圧を及ぼす。遺伝子変異の数は、EAC進行することで中に同定されている。しかし、これにもかかわらず、細胞のシグナル伝達における正確な変化および細胞構造および機能に対するその後の影響についての明確な理解の欠如がある。インビトロ細胞株において不死化に特に標的化治療化合物の効果を調査において、細胞シグナル伝達の効果を研究するための有用なツールである。 BE不死細胞株の最近の商業的利用可能性は、そのような研究を可能にする。そのような広く使用されている生存率アッセイなどのハイスループットアッセイは、細胞増殖およびsuの際に標的療法の効果を評価する上で貴重であることができるが4-6 rvival、これらのアッセイは、細胞の形態に依存細胞シグナル伝達の効果を問い合わせるために有用ではない。免疫蛍光染色（IF）は、細胞の形態、増殖、および生存特性および関与するタンパク質の際に標的療法の効果を調査するための有用な技術である。当研究室では、薬物治療7の可能な化学予防治療とバイオマーカーの輪郭を描くことを望んでも細胞株の際に臨床的に利用可能な薬剤の効果を評価するためにIFを用いて、不死化細胞株に向けて、これらの方法を適応している。同様に、EACでのこれらの技術の適用は、BEと食道不死化細胞株は、EAC進行8-10にBEに関する重要な知見を描写している。標的療法で処置したBE細胞の分析は、細胞構造およびタンパク質局在化の変化の特徴付けを可能にする、値を有するIF我々は見つける。ここでは、Cに不死化細胞のIFのための私達の方法を提示薬物治療をharacterize。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、これらの細胞に対する標的療法の生理学的効果の解明に向けたBE細胞のIFを適用するための方法を説明してきました。我々はBE細胞に対してこれらの手順の使用を記載してきたが、我々は、これらの方法はまた、異なる細胞型13,17,18様々に適用可能であることを見出した。また、これらの手順は、特定のターゲットのための染色を最適化するいくつかの方法で変更することがで…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、セントジョセフの財団（AJF、LJI）と米国肺協会、RG-224607-N（LJI）からの補助金によって支えられている。
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1X), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN ANTIBIOTIC MIXTURE | Life Technologies | 15640 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexafluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
References
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