Une méthode d'immunofluorescence pour la caractérisation des cellules oesophage de Barrett
Summary
Il est nécessaire d'améliorer l'information visible sur les moteurs moléculaires de l'oesophage de Barrett. Immunofluorescence est une technique utile pour comprendre les effets de la signalisation cellulaire sur la morphologie cellulaire. Nous présentons un protocole simple et efficace pour l'utilisation de la coloration par immunofluorescence pour évaluer le traitement thérapeutique dans les cellules oesophage de Barrett.
Abstract
Adénocarcinome oesophagien (EAC) a un taux de survie global de moins de 17% et l'incidence de la CAE a augmenté de façon spectaculaire au cours des deux dernières décennies. L'un des principaux facteurs de risque de la CAE est l'oesophage de Barrett (BE), un changement de métaplasie épidermoïde de l'œsophage normale en réponse à des brûlures d'estomac chroniques. Malgré la connexion bien établie entre CAE et BE, interrogation des événements moléculaires, en particulier les voies de signalisation altérées impliquant progression de BE à EAC, sont mal compris. Beaucoup de ceci est dû à l'absence d'convenable dans des modèles in vitro disponibles pour étudier ces maladies. Récemment, les lignes BE cellulaires immortalisées sont devenus disponibles dans le commerce permettant des études in vitro de BE. Ici, nous présentons une méthode de coloration par immunofluorescence de lignes BE cellulaires immortalisées, permettant la caractérisation in vitro de la signalisation cellulaire et de la structure après exposition à des composés thérapeutiques. L'application de ces techniques se help développer comprendre les mécanismes impliqués dans la progression BE EAC et de fournir des pistes potentielles pour le traitement et la prévention de l'EAC.
Introduction
L'oesophage de Barrett (BE) est un changement de métaplasie de l'épithélium malpighien normal de l'œsophage et une conséquence de l'exposition chronique à du contenu gastrique résultant de la maladie de reflux gastro-œsophagien (RGO) 1. BE est pensé pour être un mécanisme de protection en réponse à la DIRD, mais la présence de BE confère un risque accru d'adénocarcinome de l'œsophage (EAC), une maladie qui porte un faible taux de survie significativement 1. Les estimations actuelles indiquent que jusqu'à 5,6% de la population américaine ont BE, mais comme BE est souvent asymptomatique, on pense que la majorité des BE reste non diagnostiquée 2. Comme les taux des deux RGO et EAC incidence ont connu une croissance continue 3, il est devenu important de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la progression de BE à EAC, surtout en ce qui pourrait fournir des approches thérapeutiques vers la prévention de la progression de la BE à l'EAC.
<p class="jove_content"Études> Patient dirigés ont entraîné le paradigme actuel de BE-EAC pathogenèse 1. L'inflammation chronique, des blessures et des dommages génotoxiques résultant d'une exposition prolongée à contenu gastrique exercent une pression sélective sur la lésion BE promouvoir la progression néoplasique à CAE. Un certain nombre de modifications génétiques ont été identifiées pendant BE à la progression de la CAE. Cependant, malgré cela, il ya un manque de compréhension des changements exacts dans la signalisation cellulaire et les effets subséquents sur la structure et la fonction des cellules.Immortalisées dans des lignées cellulaires in vitro sont des outils utiles pour étudier les effets de la signalisation cellulaire, en particulier dans l'étude des effets des composés thérapeutiques ciblés. La récente disponibilité commerciale de BE lignées cellulaires immortalisées permet à de telles études. Bien tests à haut débit, tels que les tests de viabilité largement utilisés, peuvent être utiles pour évaluer les effets des thérapies ciblées sur la prolifération cellulaire et survival 4-6, ces dosages ne sont pas utiles pour interroger les effets de la signalisation cellulaire sur la morphologie des cellules. Immunofluorescence (IF) est une technique utile pour étudier les effets des thérapies ciblées sur les caractéristiques morphologiques, la croissance et la survie des cellules et des protéines qui sont impliquées. Notre laboratoire a adapté ces méthodes vers des lignes BE cellulaires immortalisées, en utilisant SI pour évaluer les effets d'un médicament cliniquement disponibles sur des lignées cellulaires de BE dans l'espoir de délimiter un éventuel traitement chimiopréventifs et biomarqueur pour le traitement de la drogue 7. De même, l'application de ces techniques dans la CAE, BE et les lignées cellulaires immortalisées de l'œsophage a délimité conclusions critiques concernant BE à la progression de la CAE 8-10. Nous trouver si l'analyse de cellules être traités avec des thérapies ciblées a de la valeur, ce qui permet pour la caractérisation des changements dans la structure de la cellule et la localisation des protéines. Ici, nous présentons nos méthodes de SI de immortalisées être des cellules à characterize traitement de la toxicomanie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons décrit une méthode pour l'application de l'IF de cellules de BE à élucider les effets physiologiques des thérapies ciblées sur ces cellules. Alors que nous avons décrit l'utilisation de ces procédures à l'égard des cellules de BE, nous avons constaté que ces procédés sont également applicables à une variété de types cellulaires différents 13,17,18. En outre, ces procédures peuvent être modifiées de plusieurs façons d'optimiser coloration pour des objectifs …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du St, la Fondation Joseph (AJF, LJI) et l'American Lung Association, RG-224607-N (LJI).
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1X), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN ANTIBIOTIC MIXTURE | Life Technologies | 15640 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexafluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
References
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