على الطريقة مناعي لتوصيف خلايا المريء باريت
Summary
هناك حاجة ملحوظة لتحسين المعلومات عن السائقين الجزيئية من المريء باريت. تلوين مناعي هو تقنية مفيدة لفهم آثار إشارة الخلية على مورفولوجيا الخلايا. نقدم بروتوكول بسيطة وفعالة لاستخدام مناعي تلطيخ لتقييم العلاجية في خلايا المريء باريت.
Abstract
غدية المريء (EAC) لديه معدل البقاء على قيد الحياة عموما أقل من 17٪ وارتفع معدل الإصابة EAC بشكل كبير خلال العقدين الماضيين. واحد من عوامل الخطر الرئيسية للEAC هو المريء باريت (BE)، وهو تغيير حؤولي من المريء الحرشفية العادي ردا على حرقة مزمنة. على الرغم من اتصال راسخة بين EAC وأن تكون والاستجواب من الأحداث الجزيئية، وخاصة مسارات الإشارات التي تنطوي على تغير تطور هو EAC، ولا يزال الغموض يكتنف. الكثير من هذا يعود لعدم وجود مناسبة في نماذج المختبر متاح لدراسة هذه الأمراض. في الآونة الأخيرة، أصبحت خطوط BE خلية خلد المتاحة تجاريا يسمح لفي المختبر دراسات BE. هنا، نقدم طريقة لتلوين مناعي من خطوط الخلايا خلد BE، مما يسمح في توصيف المختبر من إشارات الخلية والهيكل بعد التعرض للمركبات العلاجية. وتطبيق هذه التقنيات هيلع تطوير التبصر في الآليات التي تشارك في BE لEAC التقدم وتوفير السبل المحتملة للعلاج والوقاية من EAC.
Introduction
المريء باريت (BE) هو تغيير حؤولي في ظهارة الحرشفية العادي من المريء ونتيجة التعرض المزمن لمحتويات المعدة الناتجة عن مرض الجزر المعدي المريئي (GERD) 1. BE ويعتقد أن تكون آلية وقائية في التصدي لارتجاع المريء، ولكن وجود BE يضفي على زيادة خطر غدية المريء (EAC)، وهو المرض الذي يحمل الفقراء بشكل كبير البقاء على قيد الحياة 1. وتشير التقديرات الحالية إلى أن ما يصل إلى 5.6٪ من سكان أمريكا قد تكون، ولكن كما هو في كثير من الأحيان أعراض BE، ويعتقد أن غالبية BE لا تزال غير مشخصة 2. كما شهدت معدلات وقوع كل من ارتجاع المريء وEAC استمرار النمو 3، فقد أصبح من المهم لفهم الآليات الجزيئية المشاركة في تطور BE لEAC، وخصوصا هذه المعلومات يمكن أن يوفر النهج العلاجية من أجل منع تطور BE لEAC.
<p class="jove_content"وقد أسفرت نتائج الدراسات> المريض الموجهة في النموذج الحالي من BE-EAC المرضية 1. الالتهابات المزمنة، والإصابات، والأضرار السمية الناتجة عن التعرض لفترات طويلة لمحتويات المعدة ممارسة ضغوط انتقائية على BE الآفة تعزيز تطور الأورام لمجموعة شرق افريقيا. وقد تم تحديد عدد من التعديلات الوراثية خلال BE لتطور EAC. ومع ذلك، على الرغم من هذا هناك نقص واضح في الفهم عن التغييرات الدقيقة في إشارة الخلية والآثار اللاحقة على بنية الخلية ووظيفتها.خلدت في خطوط الخلايا في المختبر هي أدوات مفيدة لدراسة آثار إشارة الخلية، ولا سيما في التحقيق في الآثار المترتبة على المركبات العلاجية المستهدفة. توافر التجارية مؤخرا مخلد BE خطوط الخلايا يسمح لمثل هذه الدراسات. على الرغم من أن فحوصات عالية الإنتاجية، مثل فحوصات الجدوى المستعملة على نطاق واسع، ويمكن أن تكون ذات قيمة في تقييم آثار العلاجات المستهدفة على تكاثر الخلايا وسوrvival 4-6، وهذه المقايسات ليست مفيدة لاستجواب آثار إشارة الخلية على مورفولوجيا الخلايا. تلطيخ مناعي (IF) هو تقنية مفيدة للتحقيق في آثار العلاجات المستهدفة على الخصائص المورفولوجية، والنمو، والبقاء على قيد الحياة من الخلايا والبروتينات التي ينطوي عليها. مختبرنا تكيفت هذه الطرق نحو خطوط BE خلية خلد، وذلك باستخدام IF لتقييم آثار المخدرات المتوفرة سريريا على خطوط الخلايا BE أملا في ترسيم ممكن علاج chemopreventative والعلامات البيولوجية لعلاج المخدرات 7. وبالمثل، وتطبيق هذه التقنيات في مجموعة شرق افريقيا، وتكون خطوط الخلايا خلد المريء وقد حددت نتائج حاسمة بشأن BE لEAC تطور 8-10. نجد IF تحليل الخلايا BE تعامل مع العلاجات المستهدفة لها قيمة، مما يسمح لتوصيف التغيرات في بنية الخلية والترجمة البروتين. هنا، نقدم طرقنا لIF من الخلايا BE مخلد إلى جharacterize العلاج من تعاطي المخدرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أوجزنا طريقة لتطبيق IF الخلايا BE نحو توضيح الآثار الفسيولوجية للالعلاجات المستهدفة على هذه الخلايا. في حين وصفناها استخدام هذه الإجراءات نحو الخلايا BE، وجدنا أن هذه الأساليب تنطبق أيضا على مجموعة متنوعة من أنواع مختلفة من الخلايا 13،17،18. علاوة على ذلك، يمكن …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من شارع مؤسسة جوزيف (AJF، LJI) وجمعية الرئة الأمريكية، RG-224607-N (LJI).
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1X), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN ANTIBIOTIC MIXTURE | Life Technologies | 15640 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexafluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
References
- Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. Barrett’s oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).
- Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. The prevalence of Barrett’s esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data. Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).
- Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age. J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).
- Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. Inhibition of Barret’s adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins. J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).
- Peng, D., et al. Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells. Gut. 61, 1250-1260 (2012).
- Vona-Davis, L., et al. MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett’s adenocarcinoma in vitro. Surg. Res. 127, 53-58 (2005).
- Inge, L. J., et al. a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett’s esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia. Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).
- Jovov, B., et al. Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett’s cell line (BAR-T). Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).
- Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition. BMC Cancer. 11, 461 (2011).
- Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. In benign Barrett’s epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks. Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).
- Palanca-Wessels, M. C. A., et al. Extended lifespan of Barrett’s esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model. Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).
- Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett’s esophagus. Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).
- Inge, L. J., et al. alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling. Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).
- Coluccia, A. M. L., et al. SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of β-Catenin and Its Nuclear Signaling. Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).
- Nam, J. -. S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis. Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).
- Chu, I., et al. p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2. Cell. 128, 281-294 (2007).
- Inge, L. J., et al. Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor. Exp. Res. 317, 838-848 (2011).
- Gan, Y., et al. Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells. Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).
