Un método de inmunofluorescencia para la caracterización de las células del esófago de Barrett
Summary
Existe la necesidad de mejorar la información discernible en los conductores moleculares de esófago de Barrett. La tinción de inmunofluorescencia es una técnica útil para la comprensión de los efectos de la señalización celular en la morfología celular. Se presenta un protocolo simple, efectiva para el uso de la tinción de inmunofluorescencia para evaluar el tratamiento terapéutico en las células del esófago de Barrett.
Abstract
El adenocarcinoma de esófago (EAC) tiene una tasa de supervivencia global de menos del 17% y la incidencia de EAC ha aumentado drásticamente en las últimas dos décadas. Uno de los principales factores de riesgo de EAC es el esófago de Barrett (EB), un cambio metaplásico del esófago escamoso normal en respuesta a la acidez crónica. A pesar de la relación bien establecida entre la CAO y la SER, el interrogatorio de los eventos moleculares, en particular las vías de señalización alteradas involucran progresión de la SER para EAC, son poco conocidos. Mucho de esto es debido a la falta de adecuada en modelos in vitro disponibles para estudiar estas enfermedades. Recientemente, las líneas celulares inmortalizadas BE se han convertido en disponibles en el mercado que permite estudios in vitro de BE. A continuación, presentamos un método para la tinción de inmunofluorescencia de líneas celulares inmortalizadas BE, lo que permite la caracterización in vitro de la señalización celular y la estructura después de la exposición a los compuestos terapéuticos. La aplicación de estas técnicas se help a desarrollar una idea de los mecanismos implicados en BE para EAC progresión y abren una posible vía para el tratamiento y prevención de la EAC.
Introduction
El esófago de Barrett (EB) es un cambio metaplásico en el epitelio escamoso normal del esófago y una consecuencia de la exposición crónica a los contenidos gástricas asociadas a la enfermedad de reflujo gastroesofágico (ERGE) 1. BE se piensa que es un mecanismo de protección en respuesta a la ERGE, sin embargo, la presencia de EB imparte un mayor riesgo de adenocarcinoma de esófago (EAC), una enfermedad que conlleva una significativa baja supervivencia 1. Las estimaciones actuales indican que hasta un 5,6% de la población estadounidense tiene EB, sin embargo, como BE es a menudo asintomática, se piensa que la mayoría de BE no se diagnostica 2. Como las tasas de incidencia tanto de la ERGE y EAC han visto un crecimiento continuo 3, se ha convertido en importante para comprender los mecanismos moleculares implicados en la progresión de la SER para EAC, sobre todo ya que esta información podría potencialmente proporcionar enfoques terapéuticos destinados a prevenir la progresión de la SER para EAC.
<p class="jove_content"estudios> Paciente dirigidos se han traducido en el paradigma actual de BE-EAC patogénesis 1. La inflamación crónica, lesiones y daño genotóxico como resultado de la exposición prolongada a los contenidos gástricos ejercen una presión selectiva sobre la lesión SER promoción de la progresión neoplásica de EAC. Una serie de alteraciones genéticas han sido identificadas durante la BE a la progresión de la CAO. Sin embargo, a pesar de esto hay una clara falta de comprensión acerca de los cambios exactos en la señalización celular y los efectos posteriores sobre la estructura y la función celular.Inmortalizada en líneas celulares in vitro son herramientas útiles para estudiar los efectos de la señalización celular, sobre todo en la investigación de los efectos de los compuestos terapéuticos dirigidos. La reciente disponibilidad comercial de BE líneas celulares inmortalizadas permite para tales estudios. Aunque los ensayos de alto rendimiento, tales como los ensayos de viabilidad ampliamente usados, pueden ser valiosas para determinar los efectos de las terapias dirigidas sobre la proliferación celular y Dorvival 4-6, estos ensayos no son útiles para interrogar a los efectos de la señalización celular en la morfología celular. La tinción de inmunofluorescencia (IF) es una técnica útil para la investigación de los efectos de las terapias dirigidas en las características morfológicas, crecimiento y supervivencia de las células y las proteínas que están implicadas. Nuestro laboratorio ha adaptado estos métodos hacia líneas celulares inmortalizadas BE, usando IF para evaluar los efectos de un fármaco clínicamente disponibles a líneas celulares de BE con la esperanza de delinear un posible tratamiento quimiopreventivo y biomarcadores para el tratamiento de drogas 7. Del mismo modo, la aplicación de estas técnicas en la EAC, BE y líneas de células esofágicas inmortalizadas ha delineado los hallazgos críticos respecto a BE a EAC progresión 8-10. Hemos de encontrar si el análisis de las células pueden tratar con terapias dirigidas tiene valor, lo que permite la caracterización de los cambios en la estructura celular y localización de la proteína. A continuación, presentamos nuestros métodos de SI de ser células inmortalizadas a characterize tratamiento farmacológico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos esbozado un método para la aplicación de SI de las células de BE a la aclaración de los efectos fisiológicos de las terapias dirigidas sobre estas células. Aunque se han descrito el uso de estos procedimientos hacia células BE, hemos encontrado que estos métodos son también aplicables a una variedad de diferentes tipos de células 13,17,18. Además, estos procedimientos pueden ser alterados de varias maneras de optimizar la tinción para objetivos específicos.
Nos …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas de la St, Fundación de José (AJF, LJI) y la Asociación Americana del Pulmón, RG-224607-N (LJI).
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
| CP-A (Metaplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4027 | |
| CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4028 | |
| CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4029 | |
| CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line) | ATCC | CRL-4030 | |
| Keratinocyte-SFM (1X), Liquid | Life Technologies | 17005-042 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200056 | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified, HI | Life Technologies | 10438026 | |
| PSN ANTIBIOTIC MIXTURE | Life Technologies | 15640 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI | Life Technologies | P36931 | |
| Circular Glass Coverslip 18mm | Fisher Scientific | 15-183-86 | |
| β-catenin Primary Antibody (Rabbit) | Cell Signaling | 9562S | |
| Alexafluor 488 (Goat Anti-Rabbit) | Life Technologies | A11008 | |
| 10cm TC treated PS dish, sterile | USA Scientific | CC7682-3394 | |
| 12-well TC treated PS plate, sterile | USA Scientific | 5666-5180 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Ammonium chloride | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Bovine Serum Albumin – Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| SKI-606 (Bosutinib) | Selleck Chemicals | S1014 | |
| Square Bioassay Dish | Thermo Scientific | 240835 | |
| Parafilm | VWR | 82024-546 | |
| Disposable Pasteur Pipets, Flint Glass | VWR | 14672-380 | |
| Nexcelom Mini Cell Counter | Nexcelom | ||
| Cellometer Counting Chambers | Nexcelom | CHT4-SD100-014 | |
| Zeiss Apotome microscope | Zeiss |
References
- Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. Barrett’s oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis. Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).
- Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. The prevalence of Barrett’s esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data. Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).
- Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age. J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).
- Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. Inhibition of Barret’s adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins. J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).
- Peng, D., et al. Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells. Gut. 61, 1250-1260 (2012).
- Vona-Davis, L., et al. MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett’s adenocarcinoma in vitro. Surg. Res. 127, 53-58 (2005).
- Inge, L. J., et al. a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett’s esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia. Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).
- Jovov, B., et al. Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett’s cell line (BAR-T). Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).
- Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition. BMC Cancer. 11, 461 (2011).
- Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. In benign Barrett’s epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks. Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).
- Palanca-Wessels, M. C. A., et al. Extended lifespan of Barrett’s esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model. Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).
- Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett’s esophagus. Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).
- Inge, L. J., et al. alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling. Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).
- Coluccia, A. M. L., et al. SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of β-Catenin and Its Nuclear Signaling. Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).
- Nam, J. -. S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis. Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).
- Chu, I., et al. p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2. Cell. 128, 281-294 (2007).
- Inge, L. J., et al. Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor. Exp. Res. 317, 838-848 (2011).
- Gan, Y., et al. Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells. Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).
