Introduction
Mänskliga enter virus är viktiga smittämnen vattenburna sjukdomar 1-3, men är i allmänhet närvarande i lågt antal i förorenade miljö vatten, vilket gör deras upptäckt svårt utan koncentration. Förfaranden som används för att koncentrera virus innefattar typiskt ett filtreringssteg, följt av filter eluering, och sekundär koncentration av filter eluatet. En vanlig filtreringsförfarande bygger på användning av laddade membran såsom elektrofilter (nyligen granskats i 4,5). Dessa filter är beroende av att fånga virus suspenderade i vatten med hjälp av elektrostatiska interaktioner mellan filterytan (positivt laddade) och riktade viruspartiklar (negativt laddade). Två elektrofilter som är kommersiellt tillgängliga förlita sig på denna teknik, glas / cellulosa och nanoaluminiumoxid / glasfiberfilter. De glas / cellulosa filterkostnader är upp till 10 gånger den nanoaluminiumoxid / glasfiber, som begränsar användningen av glas / cellulose filter för rutinövervakning virus. Nya studier har ingått skillnader är nominella mellan dessa två filter i återvinning av enterovirus från omgivande vatten 6,7, motiverar användningen av ett billigare filteralternativ. Andra filteralternativ såsom elektro och glasull filter har studerats, men de kräver antingen förbehandling av käll vatten (elektrofilter) eller inte är kommersiellt tillgängliga (glasull filter). Utvecklingen av förfaranden viruskoncentrations har främst fokuserat på att optimera primära koncentrationstekniker (filter) för att förbättra virusåtervinningar från vatten. Men sekundära koncentrationsförfaranden, som minskar volymen av elueringsmedlet typiskt från 1 L för att milliliter volymer, kan också ha en betydande inverkan på virus återvinningar 8.
Sekundär koncentration av enter virus bygger vanligtvis på ett flockningsmedel, såsom vissa typer av nötkött extrakt (organisk floccuning) eller skummjölk flock 9-12 för att ta bort viruspartiklar från filterytor. Nyligen har en annan sekundär procedur koncentration med användning av köttextrakt i kombination med tillsats av Celite (fin partikel) visat lovande för utvinning adenovirus, enterovirus, och norovirus 8,13,14. Celite koncentrations verk enligt liknande principer till den för den organiska flockningsmetod genom att viruspartiklar fäster till och frisätts från partiklar (flock eller celit) genom att förändra pH suspensionslösning. Jämförelser mellan dessa två sekundära tekniker koncentrations har utvärderats i återvinning av spetsade adenovirus (ADV) typerna 40 och 41 8. Slutsatsen Denna studie att de två sekundära tekniker koncentrations var statistiskt lika i återvinning av adenovirus. Emellertid kräver det organiska flockningsmetod en 30 min. inkubation vid pH 3,5, medan den celit teknik kräver en kortare inkubering (10 min) vid pH 4,0. Den organiska flocculatjon kräver också användningen av dyra laboratorieutrustning (centrifuger) för att samla flock partiklar under tertiär koncentration, den Celite tekniken däremot använder bara grundläggande laboratorieutrustning (vakuumfiltrering) för att separera Celite partiklar från fjädring.
Vissa kombinationer av filter och sekundära elueringstekniker kan också påverka virusåtervinningar. En studie kom fram till att vissa kombinationer av primära (elektrofilter) och sekundära koncentrationstekniker (Celite eller organiskt flock) haft en betydande inverkan på återvinning av adenovirus 13. Dessa resultat tyder på att optimeringen krävs för att optimalt återhämta mål virus från en given vattenmatris när du använder dessa tekniker. Optimering är en tidskrävande, mödosam process många forskare undviker aktivt sedan flera variabler kommer att utvärderas (filtertyp / varumärke, pH elueringslösning, celit / organisk flock).
För denna sTudy, var ett förfarande utvecklats för att identifiera optimala förhållanden för viruskoncentration från vatten med hjälp av spetsade humant adenovirus stammar 40 och 41. Förmodligen eftersom varje virustyp visar en unik kapsid morfologi och specifik kapsid laddning, kan protokoll koncentrations måste optimeras för varje virus rikta för att uppnå optimal viral återhämtning. Denna studie ger en metod för AdV 40 och 41 koncentration genom: 1) utvärdera virusåtervinningar i kranvatten med hjälp elektrofilterskivor följt av 2) utvärdering av en etablerad organisk flockmetod kontra celit tekniken som en sekundär koncentration, och 3) utvärdering av elueringsbuffertar för tertiär koncentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Glas och Filterhus
- Om inget annat anges, sterilisera alla glas, filterhus och lösningar vid 121 ° C under 15 minuter. För att säkerställa sterilitet, täcker alla öppningar eller utsatta ytor med antingen aluminiumfolie eller tejp-säkrade papper före sterilisering.
- Montera filtreringsapparat genom att fästa filterhuset (47 mm diameter) till 1 L sidoarm Erlenmeyerkolv. Samla filter krävs: 47 mm diameter elektro / elektroskivfilter.
- Bered en L av 1,5% köttextrakt (flockulering; producerar flockpartiklar när pH i lösningen sänks till 3,5, eller icke-flockande; som samlar inte vid pH 3,5), med 0,05 M glycin, genom att lösa 15 g köttextrakt i 1 L avjoniserat vatten och tillsats av 3,75 g glycin.
OBS: Icke-flockningsextrakt nötkött kräver tillsats av celit före tertiär koncentration. - Lägg eluering tillsats natrium polyphosphate till nötkött extrakt vid en 0,1% koncentration.
- Lägg en M saltsyralösning, droppvis, till blandningsköttextrakt, pH-lösning till önskat pH. Autoklav nötkött extrakt för 15-30 min vid 121 ° C.
- Mät 0,1 g fin, medium eller stor partikel celite (för användning med icke-flock nötkött endast extrakt).
- Förbered vakuum / sug genom att fästa kompatibla slang till Erlenmeyer sidoarm kolv och vakuumuttaget.
2. Beredning av lösningar och virus Stock
- Bered en L av 1 M HCl.
- Bered en L av 1 M NaOH.
- Bered 1x PBS-lösning (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,47 mM K 2 PO 4, och 4,3 mM NaH 2 PO 4).
- Justera pH i 1x PBS till 9,0 med användning av 1 M NaOH.
- Förbered och utspädd stamvirus till 10 4 -10 5 mest sannolika antal (MPN) ml -1 genom att blanda 1 ml av stamvirus med 9 ml PBS (pH7), som tidigare beskrivits 8,13. Förvara vid -80 ° C i 1 ml alikvoter.
- Sterilisera virus lager med spruta filtrering (0,22 um porstorlek) för att avlägsna eventuella föroreningar.
- Avklorerat kranvatten
- Åtgärd 1 L sterilt kranvatten med användning av en steril graderad cylinder och häll i en 2 L bägare innehållande magnetisk omrörarstav.
- Lägg 0,7 g natriumtiosulfat och blanda tills granulat upplöses. Justera pH i kranvatten till 7-7,5 vid behov med användning av en M HCl eller 1 M NaOH-lösning.
- Tina virus spike (1 ml) och tillsätt hela volymen av spik till en liter avklorerat sterilt kranvatten. Blanda under 10 min.
- Bered en metod ämne (avklorerat kranvatten utan adenovirus) med varje experiment och processen på samma sätt som provet med tillsats.
3. Beredning av Millipore Filter Apparatus
- Avlägsna steril täcker över filterhuset. Säkerordentlig passning mellan filterhus övre skål och undre filterskärmen för att undvika provläckage under filtreringen.
- Ta sterilt täck 1 L Erlenmeyerkolv. Se till att korken av filterenheten passar tätt i övre öppning Erlenmeyerkolv, vilket skapar en god tätning.
- Ta bort övre skål med filterenhet från lägre filterskärmen och placera 47 mm elektrofilter disk hållet över skärmen med steril pincett. Bifoga filterhus skålen till botten skärmen och låses på plats genom att vrida moturs.
4. Tryck Water Filtration (Primary Koncentration)
- Mät 100 ml virus spiked kranvatten med steril mätcylinder.
- Häll 100 ml virus spetsade kranvatten i filterhus som innehåller antingen en 47 mm veckad glas / cellulosa filter eller ett nanoaluminium / glasfiber diskfilter.
- Låt vattnet sakta passera genom filtret. Applicera mild vakuum för att avlägsna kvarvarande rester of kranvatten från filterytan.
- Vid användning av trypsinbehandling, tillsätt 5 ml 0,25% trypsin för att filtrera yta och inkubera i 5 min.
- Tvätta trypsin från filterytan med 50 ml sterilt avjoniserat vatten.
5. Virus Eluering från Filter
- Ta bort filterhuset från 2 L Erlenmeyerkolv, och placera på 250 ml sidoarm kolv.
- Mät 100 ml nötkött extrakt med hjälp mätglas. Häll långsamt 100 ml köttextrakt i filterhuset.
- Tillåt nötkött extrakt att hälla genom filter, fånga köttextrakt i en liten (250 ml) Erlenmeyerkolv. Applicera vakuum för att dra igenom resterande nötkött utdrag ur filtret.
6. Celite Sekundär Koncentration
- Transfer kolvar innehållande de eluerade virus till en omrörarplatta. Tillsätt steril magnetisk omrörarstav och plats på omrörarplatta, blandning för att skapa liten virvel.
- Lägg 0,1 g celitpulver till 100 ml köttextrakt och låta celit att skingra. Placera steril pH sond i köttextrakt.
- Lägg släppa klokt 1 M HCl till nötköttsextrakt för att uppnå pH 4,0. Låt sakta blanda under 10 min.
- Placera 47 mm förfilter på filterhuset (som tidigare beskrivits) med en 2 L Erlenmeyerkolv.
- Häll 100 ml nötkött extrakt / celit blandningen över förfilter. Låt köttextrakt att hälla igenom. Applicera lätt vakuum för att dra igenom resterande nötkött utdrag ur filtret.
- Placera metallrör klipp på slutet av filterhuset pipen. Bifoga steril 15 ml polypropylen provrör till metallrör klipp. Placera filterhuset tillbaka till Erlenmeyerkolv.
- Tillsätt 5 ml av 1 x PBS-buffert, pH 9,0 över celite uppsamlades på förfiltret.
- Tillåt PBS droppa igenom förfiltret. Applicera lätt vakuum för att dra igenom resterande PBS i 15 ml provrör.
7. Organisk Flockulering Sekundär Koncentration
- Överför bägare innehållande den eluerade viruset till en omrörningsplatta. Lägg steril magnetisk omrörare till 100 ml köttextrakt och blanda för att skapa viss virvel.
- Placera steril pH sond i köttextrakt.
- Tillsätt 1 M HCl droppvis till köttextrakt och justera pH till 3,5. Blanda under 30 min.
- Häll eluatet i 250 ml centrifug koniska rör och centrifugera vid 2500 xg under 15 min vid 4 ° C.
- Häll av supernatanten till att inte att inte störa pelleten. Återsuspendera pelleten i 5 ml 1 x PBS, pH 9.
- Centrifugera suspensionen vid 4000 xg under 10 min vid 4 ° C. Häll av supernatanten och kasta pelleten.
- Justera pH till 7-7,5, filter sterilisera genom 0,22 ìm sprutfilter och frysa vid -80 ° C.
8. Viral Nucleic Acid Extraction
- Extrahera virala nukleinsyror med användning av en lämplig kommersiellt kit enligt tillverkarens instruktioner.
- Använd primers och prober samt reaktionsblandning och termisk cykling profiler som offentliggjorts 8,13.
OBS: Beräknad detektionsgränsen för analysen är ungefär 5 qPCR enheter per reaktion. - Lägg komponenter av PCR amplifieringsblandningar vid koncentrationer enligt följande: 10 mM Tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 4,5 mM MgCl2, 10 mM dNTP, 10 | iM primers och ett iM sond och 0,5 | il polymeras så att slutvolymer av 45 il kan tillsättas till lämpligt antal brunnar i en 96-brunnars PCR-reaktionsplatta.
- Belastning 45 l av PCR amplifieringsblandningen till varje lämplig brunn i en 96-håls, snabb reaktion PCR-platta.
- Lägg 5 pl av DNA extraherat prov till lämpliga brunnar i PCR-plattan.
- Täckplatta med värmetålig locktätning, snurra plattan för att flytta några droppar till botten av PCR plattbrunnar.
- Ställ PCR förstärkningscykler som follows: 95 ° C under 10 min, följt av 40 cykler av 95 ° C under 15 sek och 60 ° C under 1 min.
10. Dataanalyser
- Analysera trefaldiga mätningar av serie 5-faldiga utspädningar av proverna spänner 1: 5 till 1: 625 spädintervall för att bestämma det mest sannolika antalet (MPN) av viruspartiklar, som tidigare beskrivits 8,13.
- Analysera seriella 5-faldiga utspädningar av adenovirus experimentella spikar spänner 1: 5 till 1: 15,625 spädintervall för att bestämma det mest sannolika antalet (MPN) av viruspartiklar.
- Använda EPA MPN kalkylator (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), justera räknaren till svars för typ av utspädning (1: 5 eller 1:10), antal späd utfört, och antalet replikera prover spädningsserie.
- Utför log 10 transformation av data, följt av normalisering till en volymenhet (t.ex., 1 ml, 100 ml, etc.
- Utvärdera effekten av de olika experimentella variabler (t.ex. olika Celite typer, pH-områden, olika filtertyper och olika sekundära tekniker koncentrations) på Adv återvinningar genom att utföra parametriska eller icke-parametriska statistiska test (t.ex. parat t-test, en eller två vägs ANOVA) beroende på fördelningen av uppgifter och experimentell design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Celite urval
Tre olika typer av celit testades inför val av bästa presterande varianten. Celites med fin till medelstora partiklar producerade de högsta adenovirus återvinningar. Användning av större celites resulterade i lägre återvinningar för både AdV40 och 41 (intervall 32% -100%) (Figur 1). Genomsnittsåterfynd av adenovirus 40 var 144% ± 52% (fin), 115% ± 28% (medium) och 82% ± 53% (stora) partikel celites och AdV41, 132% ± 39% (fin), 83% ± 25% (medium) och 50% ± 11% (stor). Envägs ANOVA indikerade den optimerade celit tekniken utvinnas statist liknande nivåer av AdV40 (P = 0,7920) och 41 (P = 0,1439) till det av det organiska flockningsmetod, som återhämtade 75% ± 19% och 109% ± 16%, respektive . Figur 1 illustrerar skillnaderna mellan sekundära tekniker koncentration och mellan Adv typer.
_content "> utvärdering FiltertypHundra milliliter volymer av virus spetsade, kranvatten koncentrerades med antingen en veckad glas / cellulosa eller nanoaluminiumoxid / glasfiber skivfilter och bearbetades med antingen celit eller organiskt flockmetod. Filter eluerades med nötköttsextrakt vid pH 7,5, 9,0, 9,5, 10, 11 och 12 för att bestämma vilket skulle vara mest effektiv för att eluera ADV partiklar från filter. Filter glas / cellulosa tillsammans med köttextrakt vid pH 10 och celit, producerade de högsta återhämtning (genom qPCR / MPN) för AdV40 (52% ± 22%) och AdV41 (64% ± 4%), som visas i figurerna 2 och 3. Nötkött extrakt pH 10 återvinnas betydligt högre AdV41 än alla andra pH-värden (P-värde range: ,0045-0,041), medan AdV40 följde en liknande, om än något svagare utveckling (P värdeområde: 0,025-0,042). Ett glas / cellulosa-filter utvärderades också i samverkan med den organiska flocculation metod. För AdV40, var signifikant högre återvinningar som gjorts med hjälp av köttextrakt pH 10 (40% ± 10%) (P värdeområde: 0,010-0,027), och för AdV41, både pH 9,5 och 10 överträffade alla andra köttextrakt pH testade (P värdeområde : 0,023-0,027) (figur 2 och 3). Sammantaget var det celit tekniken med nötkött extrakt pH 10 befunnits vara överlägsen den organiska flockningsmetoden i direkta jämförelser för återvinning av både ADV stammarna.
Optimeringar av nötkött extrakt tillsatser
Den optimerade metoden (glas / cellulosa filtret med nötkött extrakt pH 10 i kombination med celit sekundär koncentration) jämfördes med två andra behandlingar: 1) tillägg av 0,25% trypsin och 2) om komplettering av nötkött extrakt med 0,1% natriumpolyfosfat. Tillsatsen av trypsin föll inte att förbättra återvinningen av AdV som endast 16% ± 6% och 24% ± 14% av AdV40 och 41 ingångar, respektive återvanns (< strong> Figur 4). Nötkött extrakt kompletterat med 0,1% natriumpolyfosfat gav de högsta återvinningar av AdV40 och 41 jämfört med den för den tidigare optimerad metod. AdV40 återhämtningen tycktes öka med 13%, och AdV41 återhämtning ökade 7% jämfört med föregående metod, men inte heller var statistiskt signifikant (P-värde: 0,146). Användning av högre halter av natriumpolyfosfat 1%, 3% och 5% (data ej visade) visade sig vara ineffektiva, vilket kräver stora volymer av syra för att justera pH för dessa lösningar till 4,0 under sekundär koncentration.
Figur 1: Procentuell återvinning av AdV-40 och ADV-41 bygger på sekundära koncentrationsteknik (Celite kontra Organic flock) och den typ av Celite används. Felstaplar representerar standardavvikelse (n = 3) 8.
Figur 2: Procent återvinning av AdV-40 med hjälp av två typer av sekundära tekniker koncentrations (Celite och organiskt flock) och två typer av filter (Glas / Cellulosa och Nano-aluminiumoxid / Glas) vid varierande pH-nivåer av nötkött extrakt. Felstaplar representerar standardavvikelse (n = 3) 13.
Figur 3: Procent återvinning av AdV-41 med hjälp av två typer av sekundära tekniker koncentrations (Celite och organiskt flock) och två typer av filter (Glas / Cellulosa och Nano-aluminiumoxid / Glas) vid varierande pH-nivåer av nötkött extrakt. Felstaplar representerar standardavvikelse (n = 3) 13.
Figur 4: Effekten av elueringsbetingelser tillsatser om återvinning av AdV 40 och AdV 41 koncentrerad använder Celite som en sekundär koncentrationsteknik och Glas / Cellulosa. Felstaplar representerar standardavvikelse (n = 3) 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elektrofilter är användbara koncentrera virus från vatten; emellertid dessa filter kan skilja sig i sin struktur och sammansättning, eventuellt i sin tur ändrar deras effektivitet. Compounding detta problem, kapsid strukturer och avgifter varierar mellan virusstammar som kräver koncentrationstekniker skräddarsys för att säkerställa optimal återhämtning 15. Genom enkla modifieringar av befintliga koncentrationstekniker (t.ex. elektrofilter, köttextrakt eluering), mer effektiv koncentration av mål virus kan uppnås 16,17.
Forskning har hittills oftast fokuserar på återvinning av virus genom att ändra primär koncentration (filter) steg, men lite uppmärksamhet har ägnats åt efterföljande förfaranden koncentrations som också kan påverka virusåtervinning 18. Det har visats att olika sekundära tekniker koncentrations kan påverka virusåtervinningar 6,13,19,20. Celite koncentrationen har visat att återvinna liknande nivåer av virus till det av andra sekundära koncentrationsmetoder 8,14 från en mängd olika matriser, medan du använder snabbare och enklare förfaranden bearbetnings prov.
På grund av varierande yttre kapsid strukturer, kan vissa virus bli fysiskt instängd inuti filtermatrisen 21, vilket nödvändiggör utvärdering av olika tillsatser för att filtrera elueringsprofiler protokoll. Till exempel, tillsats av tensid, natriumpolyfosfat förbättrades både bakterier och virus återhämtning under primär koncentration 6,13,22-24. Å andra sidan kan låga återvinning observerade efter tillsats av trypsin indikerar att proteaser inte lätta klyvning av proteinfibrer på den yttre virala kapsiden. Vidare, medan inte ovanligt 7,25,26, är det värt att notera att vissa av våra återvinningarna var överstigande 100%. Som tidigare visats 7,25,26, är detta sannolikt beror på klumpar av laboratorietillverkade virus som spik.
Den lilla volymen (100 ml virus spetsade vatten) koncentration tillvägagångssätt presenteras kan vara ett praktiskt sätt att utveckla och optimera viruskoncentrationsmetoder, på grund av dess enkelhet och låg förbrukning av resurser tillsammans med quick time urval bearbetning. Med användning av sådana små volymer av vatten, är koncentrationen av PCR-inhibitorer i provet minimeras också, men det rekommenderas att utvärderas varje källa vatten med avseende på närvaro av PCR-hämmare före experimentering. Eftersom många val av både filter och sekundära tekniker koncentrations existerar, små volymkoncentrations teknik möjliggör snabba utvärderingar av många variabler. Förhoppningen är att dessa tekniker skulle kunna användas innan storskalig filtrerings experiment för att hjälpa till att identifiera vilka förutsättningar är optimala för mål viruskoncentration per givna vatten matriser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adenovirus 40 stock | ATCC | VR-931 | |
| Adenovirus 41 stock | ATCC | VR-930 | |
| Sodium Thiosulfate | Fluka Chemical Co. | 72051 | |
| Celites #577 | Fluka Chemical Co. | 22142 | |
| NanoCeram 47 mm | Argonide | N/A | |
| 1MDS 47 mm | 3M | 6408502 | |
| AP-20 Prefilter 47 mm | Millipore Corp. | AP2004700 | |
| Glycine | Sigma | 50046-1KG | |
| Sodium Polyphosphate | Acros Organics | 390930010 | |
| Trypsin | Gibco | 25200 | |
| PBS | Sigma | P5368 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher | A481-212 | |
| BBL Beef Extract | BD Biosciences | 212303 | |
| Difco Beef Extract | BD Biosciences | 211520 | |
| ABI 7900 Real-time PCR system | ABI | N/A | |
| Stainless Steel Filter Housing | Millipore Corp. | XX2004720 | |
| Blood DNA Extraction Kit | Qiagen | 51104 | |
| EPA MPN Calculator | http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html |
References
- Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review. Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).
- WHO. Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , World Health Organization. Geneva. (2003).
- Westrell, T., et al. Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom. Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, Norway, France, Sweden and Denmark. (2010).
- Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters. Environment International. 45, 151-164 (2012).
- Cashdollar, J. L., Wymer, L. Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies. Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).
- Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water. Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).
- Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water. Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).
- McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41. Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).
- Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water. Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).
- Fout, G. S., Schaefer, F. W. 3rd, Messer, J. W., Dahling, D. R. ICR microbial laboratory manual. 178, US Environmental Protection Agency. Washington, D.C. (1996).
- Calgua, B., et al. Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples. Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).
- Calgua, B., et al. Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas. Water Research. 47, 2797-2810 (2013).
- McMinn, B. R. Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters. Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).
- Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater. Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).
- Albinsson, B., Kidd, A. H. Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells. Virus Research. 64, 125-136 (1999).
- He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices. The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).
- Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin. 71, 1042-1050 (2005).
- Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods. Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).
- Haramoto, E., Katayama, H. Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters. Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).
- Lee, H., et al. Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water. Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).
- Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater. Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).
- Hill, V. R., et al. Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants. Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).
- Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water. Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).
- Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water. Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).
- Melnick, J. L., et al. Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water. Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).
- Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR. Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).
