Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen
Summary
Hier beschrijven we een efficiënte methode voor isolatie, identificatie en zuivering van muizen thymus epitheelcellen (TEC). Het protocol kan worden gebruikt voor studies van thymus functie voor normale T-cel ontwikkeling, thymus en T cel reconstitutie.
Abstract
De thymus is een vitaal orgaan voor T-lymfocyten ontwikkeling. Van thymus stromale cellen, thymus epitheelcellen (TEC) zijn vooral belangrijk bij meerdere stadia van de T-cel ontwikkeling: T-cel betrokkenheid, positieve selectie en negatieve selectie. Toch blijft de functie van TEC in de thymus onvolledig begrepen. In het artikel geven we een methode om TEC subsets van verse muis thymus met behulp van een combinatie van mechanische verstoring en enzymatische afbraak te isoleren. De werkwijze maakt thymus stromale cellen en thymocyten efficiënt vrijkomen van cel-cel en cel-extracellulaire matrix verbindingen en een eencellige suspensie. De geïsoleerde cellen kunnen multiparameter flowcytometrie worden toegepast op de identificatie en karakterisering van TECs en dendritische cellen. Omdat TEC een zeldzame celpopulatie in de thymus, ook een effectieve manier te verrijken en zuiveren TEC door afbreken thymocyten, het meest voorkomende celtype in de thymus te beschrijven. Follovleugel verrijking, celsortering tijd worden verminderd zodat het verlies van cellevensvatbaarheid tijdens zuivering van TEC's worden geminimaliseerd. Gezuiverde cellen zijn geschikt voor verschillende stroomafwaartse analyses zoals Real Time-PCR, Western blot en genexpressie. Het protocol onderzoek TEC functie en evenals de ontwikkeling van in vitro T-cel reconstitutie promoten.
Introduction
Vroeg in T-cel ontwikkeling, zijn beenmerg hematopoietische stamcellen afgeleide multipotente voorlopercellen aangeworven om de cortex van de thymus, ondergaan inzet voor T afstamming en word T cel precursoren 1. In de cortex, T-cel voorloper CD4-en CD8 dubbele ontkenning (DN) thymocytes uitbreiden en differentiëren in onvolwassen CD4 en CD8 dubbel positieve (DP) thymocytes, de vorming van een grote pool van voorouders met zeer variabele T-cel-receptoren 1. Slechts een select MHC-beperkte subset van DP cellen CD4 en CD8 enkele positieve (SP) thymocyten worden, migreren naar de medulla van de thymus en differentiëren tot functioneel bevoegde rijpe T-cellen, een gebeurtenis die wordt aangeduid als positieve selectie 2- 6. In tegenstelling, klonen van auto-reactieve thymocytes ondergaan negatieve selectie en verwijderd via apoptose, omgerekend naar regulatoire T-cellen voor zelf-tolerantie, of omgeleid naar intra-epitheliale lymfocyten voor doeleinden die nog niet duidelijk 3,7-10.
In de thymus, thymus stromale cellen vormen een unieke micro-omgeving verschaffen signalen voor deze verschillende T cel ontwikkeling lot 5,11,12. Thymus stromale cellen zijn samengesteld uit de thymus epitheelcellen (TEC) – waaronder corticale TEC's (cTECs) en medullaire TEC (mTECs), dendritische cellen, macrofagen, fibroblasten, endotheelcellen, neurale-kuif afgeleid pericytes en andere mesenchymale cellen 13-15. Onder deze, TEC's zijn cruciaal in de verschillende stadia van de T-cel ontwikkeling 1,2,16,17. Echter, het ontbreken van een robuuste manier om TEC te isoleren een uitgebreide kennis van hun functies 16 belemmerd. Vooral cTECs, die een driedimensionaal netwerk rond voorlopers in de cortex vormen, zijn essentieel voor positieve selectie 13,18,19 om redenen die nog niet duidelijk. Eerdere studies die aanwijzingen in verband met de heterogeniteit en de rol van de TEC, meestal een beroep op morfologische en histologische gereedschap 13 </sup>. Onlangs werden de unieke rol van de TEC subsets aangepakt door genetische benaderingen in muismodellen 12,20. Een robuuste en reproduceerbare manier om TEC te isoleren is fundamenteel voor onpartijdige karakterisering van TEC subsets, kwantitatieve en kwalitatieve evaluatie van de TEC-functies, en verduidelijking van de mechanismen te realiseren hoe cTECs ondersteunen positieve selectie.
Vanwege de zeldzaamheid van TEC in de thymus en de strakke interacties vormen ze in de intacte orgaan is de isolatie van TEC uitdagend. De hier beschreven protocol gebaseerd op de eerdere ontdekkingen momenteel verkrijgbare middelen, technieken en kennis van structuur en thymus stromale samenstelling. Bijna twee decennia geleden, werden verschillende procedures gemeld aan thymus weefsels 21-27, waarbij verschillende enzymen werden gebruikt tijdens de spijsvertering, waaronder trypsine, collagenase en Dispase disaggregeren. Gray et al. tegenover deze enzymen in hun precedure 28 en meldde een verbeterde method met een multiple-stap spijsvertering enzym cocktails 29 dat werd op grote schaal gebruikt 20,30. Deze werkwijze is een lange voorbereidingstijd en complexe digestie stappen en resulteert in variabele uiteindelijke cel aantallen en percentages TEC zelfs in dezelfde muizen cohort 29,30. Enkele jaren geleden, Liberase onderzoek leerjaar enzym, met daarin sterk gezuiverd Collagenase en neutraal protease begon te worden gebruikt in de thymus weefsel dissociatie 30. We beschrijven hier een Liberase spijsvertering-gebaseerd protocol, met geoptimaliseerde mechanische scheiding procedures, dat een groot aantal levensvatbare TEC levert vanaf muis thymus weefsels. .
Om gedissocieerde stromale cellen te verrijken, hebben eerdere studies ofwel gradiënten dichtheid of magnetische kraal scheiding 21,29 gebruikt. Beide methoden leiden tot ernstige verlies van bepaalde populaties van thymus stromale cellen, met name de populatie van cTECs 29. Cytotoxische eliminatie en panning technieken <sup> 31,32 zijn op grote schaal gebruikt voor uitputting of scheiding van lymfocyten in het veld immunologische 12,31. Na vergelijking van deze technieken hebben we de huidige panning protocol voor verrijking van TEC. De zachte conditie tijdens de verrijking procedure leidt tot minder celdood en onpartijdige en verhoogde TEC herstel.
De geïsoleerde thymus celsuspensie in punt 3 beschreven kunnen direct worden aangebracht op cytometrische analyse stroom voor identificatie en karakterisatie van TEC subsets en dendritische cellen. Hoofdstuk 4 beschrijft een eenvoudige en handige manier om TEC subsets met multiparameter doorstroomcytometer identificeren. Voor experimenten die streven naar gezuiverd cTECs of mTECs, TEC verrijking en celsortering procedures te verkrijgen zijn te vinden in hoofdstuk 5 en 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
In het protocol, kritische stappen zijn de voorbereiding van de thymus stromale cellen (hoofdstuk 3) en de verrijking van de TEC's (paragraaf 4). Het wordt sterk aanbevolen dat verse enzym wordt bereid elke keer en het weefsel wordt zo snel mogelijk behandeld. Voor samengevoegd thymi, optimale volume enzymoplossing wordt afhankelijk van het aantal thymi. Indien weefsel residuen na de verwerking, het toevoegen van meer enzymoplossing en verlenging incubatietijd kan celopbrengst toenemen. Tijdens de verrijking van TEC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Grant R01 AI088209 (Kah). We danken ook de Universiteit van Minnesota flowcytometrie Resource.
Materials
| Anti-mouse EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Clone G8.8 |
| Anti-mouse MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Clone M5/114.15.2 |
| Anti-mouse Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Clone 6C3 |
| UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| Flow cell sorter | BD Biosciences | FACSAria | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
References
- Rothenberg, E. V., Moore, J. E., Yui, M. A. Launching the T-cell-lineage developmental programme. Nat. Rev. Immunol. 8, 9-21 (2008).
- Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
- Klein, L., Hinterberger, M., Wirnsberger, G., Kyewski, B. Antigen presentation in the thymus for positive selection and central tolerance induction. Nat. Rev. Immunol. 9, 833-844 (2009).
- Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).
- Takahama, Y., Takada, K., Murata, S., Tanaka, K. beta5t-containing thymoproteasome: specific expression in thymic cortical epithelial cells and role in positive selection of CD8. T cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 92-98 (2012).
- Xing, Y., Wang, X., Igarashi, H., Kawamoto, H., Sakaguchi, N. Protein phosphatase subunit G5PR that regulates the JNK-mediated apoptosis signal is essential for the survival of CD4 and CD8 double-positive thymocytes. Mol. Immunol. 45, 2028-2037 (2008).
- Benoist, C., Mathis, D. Treg cells, life history, and diversity. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, a007021 (2012).
- Pobezinsky, L. A., et al. Clonal deletion and the fate of autoreactive thymocytes that survive negative selection. Nat. Immunol. 13, 569-578 (2012).
- Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 30, 95-114 (2012).
- Xing, Y., Hogquist, K. A. T-cell tolerance: central and peripheral. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, (2012).
- Anderson, G., Lane, P. J., Jenkinson, E. J. Generating intrathymic microenvironments to establish T-cell tolerance. Nat. Rev. Immunol. 7, 954-963 (2007).
- Xing, Y., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Thymoproteasome subunit-beta5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 6979-6984 (2013).
- Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. Zoned out: functional mapping of stromal signaling microenvironments in the thymus. Annu. Rev. Immunol. 25, 649-679 (2007).
- Rezzani, R., Bonomini, F., Rodella, L. F. Histochemical and molecular overview of the thymus as site for T-cells development. Prog. Histochem. Cytochem. 43, 73-120 (2008).
- Rodewald, H. R. Thymus organogenesis. Annu. Rev. Immunol. 26, 355-388 (2008).
- Griffith, A. V., et al. Spatial mapping of thymic stromal microenvironments reveals unique features influencing T lymphoid differentiation. Immunit. 31, 999-1009 (2009).
- Guerder, S., Viret, C., Luche, H., Ardouin, L., Malissen, B. Differential processing of self-antigens by subsets of thymic stromal cells. Curr. Opin. Immunol. 24, 99-104 (2012).
- Hogquist, K. A., Xing, Y. Why CD8+ T cells need diversity when growing up. Immunit. 32, 5-6 (2010).
- Jenkinson, E. J., Parnell, S., Shuttleworth, J., Owen, J. J., Anderson, G. Specialized ability of thymic epithelial cells to mediate positive selection does not require expression of the steroidogenic enzyme p450scc. J. Immunol. 163, 5781-5785 (1999).
- Murata, S., et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes. Science. 316, 1349-1353 (2007).
- Chidgey, A. P., Pircher, H., MacDonald, H. R., Boyd, R. L. An adult thymic stromal-cell suspension model for in vitro positive selection. Dev. Immunol. 6, 157-170 (1998).
- Izon, D. J., Nieland, J. D., Godfrey, D. I., Boyd, R. L., Kruisbeek, A. M. Flow cytometric analysis reveals unexpected shared antigens between histologically defined populations of thymic stromal cells. Int. Immunol. 6, 31-39 (1994).
- Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro. J. Exp. Med. 176, 845-853 (1992).
- Klein, L., Klugmann, M., Nave, K. A., Tuohy, V. K., Kyewski, B. Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells. Nat. Med. 6, 56-61 (2000).
- Shortman, K., Vremec, D., D’Amico, A., Battye, F., Boyd, R. Nature of the thymocytes associated with dendritic cells and macrophages in thymic rosettes. Cell. Immunol. 119, 85-100 (1989).
- Volkmann, A., Zal, T., Stockinger, B. Antigen-presenting cells in the thymus that can negatively select MHC class II-restricted T cells recognizing a circulating self antigen. J. Immunol. 158, 693-706 (1997).
- Yang, S. J., Ahn, S., Park, C. S., Choi, S., Kim, M. G. Identifying subpopulations of thymic epithelial cells by flow cytometry using a new specific thymic epithelial marker, Ly110. J. Immunol. Method. 297, 265-270 (2005).
- Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry. J. Immunol. Method. 260, 15-28 (2002).
- Gray, D. H., et al. Unbiased analysis, enrichment and purification of thymic stromal cells. J. Immunol. Method. 329, 56-66 (2008).
- Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin. Transl. Sci. 2, 279-285 (2009).
- Kanof, M. E. Purification of T cell subpopulations. Curr. Protoc. Immunol. 7 (Unit 7.3), (2001).
- Mage, M. G. Fractionation of T cells and B cells using panning techniques. Curr. Protoc. Immunol. 3 (Unit 3.5), (1991).
- Wekerle, H., Ketelsen, U. P., Ernst, M. Thymic nurse cells. Lymphoepithelial cell complexes in murine thymuses: morphological and serological characterization. The Journal of experimental medicin. 151, 925-944 (1980).
- Kyewski, B. A., Kaplan, H. S. Lymphoepithelial interactions in the mouse thymus: phenotypic and kinetic studies on thymic nurse cells. J Immuno. 128, 2287-2294 (1982).
- Nakagawa, Y., et al. Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor alpha rearrangement in cortical thymocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 20572-20577 (2012).
- McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J. Immunol. Method. 367, 85-94 (2011).
- Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. Journal of immunological method. 385, 23-34 (2012).
