Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Murine Thymusepithelzellen
Summary
Hier beschreiben wir ein effizientes Verfahren zur Isolierung, Identifizierung und Reinigung von Maus-Thymus-Epithelzellen (TECs). Das Protokoll für die Untersuchung der Funktion zur normalen Thymus-T-Zell-Entwicklung, Thymus Dysfunktion und T-Zell-Rekonstitution verwendet werden.
Abstract
Der Thymus ist ein wichtiges Organ für die T-Lymphozyten-Entwicklung. Von Thymus-Stromazellen sind Thymus-Epithelzellen (TEC) besonders wichtig in mehreren Stufen von T-Zell-Entwicklung: T-Zell-Engagement, positive und negative Selektionsauswahl. Allerdings bleibt die Funktion der TEC in der Thymusdrüse unvollständig verstanden. In dem Artikel wird ein Verfahren zur TEC Teilmengen aus frischen Maus Thymus mit einer Kombination von mechanischen Störungen und enzymatische Verdauung zu isolieren. Das Verfahren ermöglicht Thymus-Stroma-Zellen und Thymozyten effizient von Zell-Zell-und Zell-extrazellulären Matrix-Verbindungen freigesetzt werden, und um eine Einzelzellsuspension zu bilden. Verwendung der isolierten Zellen können Multi Durchflusszytometrie, um die Identifizierung und Charakterisierung von TECs und dendritischen Zellen verwendet werden. Da TEC sind eine seltene Zellpopulation im Thymus, wir beschreiben auch eine effektive Möglichkeit zu bereichern und zu reinigen TEC durch abbau Thymozyten, die am häufigsten vorkommende Zelltyp im Thymus. FolloFlügel die Anreicherung, Zellsortierzeit kann verringert werden, so dass der Verlust der Lebensfähigkeit der Zellen kann während der Reinigung von TEC minimiert werden. Gereinigten Zellen sind für verschiedene Downstream-Analysen wie Echtzeit-PCR, Western-Blot-und Gen-Expressionsprofilen. Das Protokoll wird die Forschung von TEC-Funktion und so gut wie die Entwicklung von in-vitro-T-Zell-Rekonstitution zu fördern.
Introduction
Frühen T-Zell-Entwicklung werden Knochenmark hämatopoetische Stammzellen abgeleiteten multipotenten Vorläuferzellen an der Rinde des Thymus rekrutiert zogen Engagement der T-Linie und zu T-Zell-Vorläufer 1. In der Rinde, T-Zell-Vorläufer-CD4 und CD8 doppelt negative (DN) Thymozyten erweitern und differenzieren sich in unreifen CD4 und CD8 doppelt positiven (DP) Thymozyten, bilden einen großen Pool von Vorläuferzellen mit sehr unterschiedlichen T-Zell-Rezeptoren 1. Nur eine ausgewählte MHC-beschränkten Teilmenge von DP-Zellen werden CD4 oder CD8 einzigen positiven (SP) Thymozyten zu werden, wandern in der Medulla des Thymus und differenzieren sich in funktional zuständigen reifen T-Zellen, eine Veranstaltung, die als positive Selektion bezeichnet wird 2 6. Im Gegensatz dazu Klone von autoreaktiven Thymozyten zogen negative Selektion und über Apoptose entfernt, um regulatorische T-Zellen, die für Selbst-Toleranz umgewandelt oder intraepitheliale Lymphozyten für Zwecke, die nicht klar sind, abgeleitet 3,7-10.
Im Thymus Thymus-Stromazellen bilden eine einzigartige Mikroumgebung, die Signale für die verschiedenen T-Zell-Entwicklung Schicksale 5,11,12. Einschließlich Rinden TECs (CTEC) und Mark TECs (mTEZ), dendritische Zellen, Makrophagen, Fibroblasten, Endothelzellen, Neuralleiste stamm Perizyten und anderen mesenchymalen Zellen 13-15 – Thymus-Stroma-Zellen von Thymus-Epithelzellen (TECs) besteht. Unter diesen sind TECs entscheidend auf den verschiedenen Stufen der T-Zell-Entwicklung 1,2,16,17. Allerdings hat noch kein robuster Weg zu isolieren TEC ein umfassendes Verständnis ihrer Funktionen 16 behindert. Insbesondere CTEC, die eine dreidimensionale Netzwerk umgebenden Vorläuferzellen im Cortex zu bilden, sind für die positive Selektion 13,18,19 aus Gründen, die nicht klar sind. Frühere Studien lieferten Hinweise auf die Heterogenität und die Rolle der TEC, meist unter Berufung auf morphologische und histologische Werkzeuge 13 </sup>. Vor kurzem hat die einzigartige Rolle der TEC Teilmengen wurden durch genetische Ansätze in Mausmodellen 12,20 gerichtet. Eine robuste und reproduzierbare Weise zu isolieren TEC ist von grundlegender Bedeutung, um unvoreingenommene Charakterisierung von TEC Teilmengen, quantitative und qualitative Bewertung der TEC-Funktionen, und die Klärung der Mechanismen zu erreichen, wie CTEC unterstützt positive Selektion.
Aufgrund der Seltenheit von TECs im Thymus und den engen Wechselwirkungen sie im intakten Organ zu bilden, die Isolierung von TECs wurde schwierig. Das hier beschriebene Protokoll basiert auf früheren Entdeckungen, die derzeit erhältlichen Reagenzien, Techniken und Kenntnisse der Thymus Struktur und Stromazellen Zusammensetzung. Vor fast zwei Jahrzehnten wurden mehrere Verfahren berichtet, Thymus Gewebe 21-27, in denen verschiedene Enzyme wurden während der Verdauung verwendet werden, einschließlich Trypsin, Collagenase und Dispase aufzuschlüsseln. Gray et al. verglichen diese Enzyme in ihrer precedure 28 und berichtet eine verbesserte Method mit einem mehrstufigen Verdauung von Enzym-Cocktails, die 29 wurde weit verbreitet 20,30. Jedoch beinhaltet dieses Verfahren eine lange Vorbereitungszeit und komplexe Schritte Verdauung und führt variable endgültige Zellzahlen und Mengenverhältnisse der TECs sogar in der gleichen Maus-Kohorte 29,30. Vor einigen Jahren Liberase Research Grade Enzym enthält hoch gereinigte Kollagenase und neutraler Protease begonnen, in Thymus Gewebedissoziation 30 verwendet werden. Hier beschreiben wir eine Liberase Verdauung-basiertes Protokoll, mit optimierten mechanischen Trennverfahren, die eine hohe Anzahl von lebensfähigen TEC aus Maus-Thymus Gewebe ergibt. .
Dissoziiert Stromazellen zu bereichern, haben frühere Studien entweder Dichtegradienten oder Magnetkügelchen Trennung 21,29 eingesetzt. , Verursachen jedoch beide Methoden schweren verloren bestimmter Populationen von Thymusstroma Zellen, insbesondere der Bevölkerung von 29 CTEC. Zytotoxische Eliminierung und Panning-Techniken <sbis> 31,32 sind weithin zur Abreicherung bzw. Abtrennung von Lymphozyten in dem immunologischen Gebiet 12,31 verwendet. Nach dem Vergleich dieser Techniken haben wir die aktuellen Panning-Protokoll zur Anreicherung von TEC. Die sanfte Zustand während der Anreicherungsverfahren führt zu weniger Zelltod und unvoreingenommene und erhöhte TEC Erholung.
Die in Abschnitt 3 beschriebenen isolierten Thymus Zellsuspension kann direkt angewendet werden, um durchflusszytometrische Analyse fließen zur Identifizierung und Charakterisierung von TEC Teilmengen und dendritischen Zellen. Abschnitt 4 beschreibt eine einfache und nützliche Methode, um Untergruppen mit TEC Multi Durchflusszytometer zu identifizieren. Für Experimente, die gereinigt oder CTEC mTEZ, TEC Bereicherung und Zellsortierverfahren zu erhalten suchen, finden Sie in Kapitel 5 und 6 zu finden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dem Protokoll sind wichtige Schritte der Zubereitung des Thymus Stromazellen (Abschnitt 3) und die Anreicherung von TEC (Abschnitt 4). Es wird empfohlen, dass frische Enzymlösung wird jeweils hergestellt, und das Gewebe wird so bald wie möglich behandelt. Für gepoolt Thymi Optimierung des Volumens der Enzymlösung wird in Abhängigkeit von der Anzahl der Thymi erforderlich. Wenn eine Gewebereste nach der Verarbeitung zurückbleiben, zu Hinzufügen von mehr Enzymlösung und Verlängerung der Inkubationszeit Zellaus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Grants R01 AI088209 (zu KAH) unterstützt. Wir danken auch der University of Minnesota Durchflusszytometrie Ressource.
Materials
| Anti-mouse EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Clone G8.8 |
| Anti-mouse MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Clone M5/114.15.2 |
| Anti-mouse Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Clone 6C3 |
| UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| Flow cell sorter | BD Biosciences | FACSAria | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
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