分离，鉴定和小鼠胸腺上皮细胞的分离纯化
Summary
在这里，我们描述了用于分离，鉴定和小鼠胸腺上皮细胞（TECs的）的纯化的有效方法。该协议可以用于胸腺功能的正常T细胞发育，胸腺机能障碍，和T细胞重建研究。
Abstract
胸腺是T细胞发展的重要器官。胸腺基质细胞，胸腺上皮细胞器（TEC）是在T细胞发育的多个阶段尤为关键：T细胞的承诺，正选择和负选择。然而，肾小管上皮在胸腺的功能尚未完全了解。在这篇文章中，我们提供了一种方法来隔离新鲜的小鼠胸腺采用机械破碎和酶消化相结合的TEC的子集。该方法允许胸腺基质细胞和胸腺细胞被有效地从细胞 – 细胞和细胞 – 细胞外基质的连接释放以形成单细胞悬浮液。使用分离的细胞，多参数流式细胞术可以应用于识别的TECs和树突状细胞和表征。由于TECs的是一种罕见的细胞群体在胸腺中，我们还描述了以丰富和消耗的胸腺细胞在胸腺中最丰富的细胞类型纯化的TECs的有效途径。 Follo翼的富集，细胞分选时可以减少这样的细胞生存力的丧失可以的TECs的纯化过程中被最小化。纯化细胞是适用于各种下游分析如实时PCR，Western blot和基因表达谱。该协议将促进TEC的功能的研究和以及体外 T细胞重建的发展。
Introduction
早在T细胞发育，骨髓造血干细胞衍生的多潜能祖细胞被募集到胸腺的皮质，经受承诺T系和成为T细胞的前体1。在皮层，T细胞前体的CD4和CD8双阴性（DN）胸腺扩大和分化为不成熟的CD4和CD8双阳性（DP）的胸腺细胞，祖细胞形成具有高度可变的T细胞受体1的大型游泳池。仅DP细胞的选择MHC限制的子集将成为CD4或CD8单一阳性（SP）的胸腺细胞，迁移至胸腺髓质，并分化为功能性主管成熟的T细胞，这被称为正选择2的事件6。与此相反，自身反应性胸腺细胞克隆进行阴性选择，并通过细胞凋亡被删除，转换为调节性T细胞的自身耐受，或改行上皮内淋巴细胞的目的是尚不清楚-3,7-10。
在胸腺，胸腺基质细胞形成了独特的微环境提供这些不同的T细胞发育命运5,11,12信号。胸腺基质细胞组成的胸腺上皮细胞（的TECs） -包括皮层的TECs（cTECs）和延髓的TECs（mTECs），树突细胞，巨噬细胞，成纤维细胞，内皮细胞，神经脊衍生的周细胞等间充质细胞13-15。在这些中，的TECs是在T细胞发育1,2,16,17的各阶段的关键。然而，缺乏一个可靠的方法来隔离的TEC阻碍了它们的功能16一个全面的了解。特别是，cTECs，形成了周围的皮质祖细胞的三维网络，是必不可少的阳性选择13,18,19，其原因尚不清楚。早期的研究提供线索的TEC的异质性和作用，主要依靠形态学和组织学的工具13 </suP>。最近TEC子集的独特作用是通过基因的方法在小鼠模型中12,20解决。一个强大的和可重复的方式来隔离的TEC是根本实现TEC的子集，对TEC的功能，定量和定性评估，并澄清机制，公正的鉴定cTECs如何支持正选择。
由于肾小管上皮在胸腺的稀有和紧张的互动，他们在完整的器官形成，肾小管上皮的分离一直是具有挑战性的。这里所描述的协议是基于先前的发现，目前可获得的试剂，技术和胸腺结构和基质组合物的知识。大约20年前，有几个程序被上报分解胸腺组织21-27，在不同的酶在消化过程中使用，包括胰蛋白酶，胶原酶和分散酶。 Gray 等人 。相比于他们的precedure 28的酶，并报告改进的甲基OD与酶鸡尾酒29，成为一个多步骤的消化广泛应用于20,30。然而，这种方法涉及到一个长的准备时间和复杂的消化步骤和结果变量最终细胞数和的TECs的比例，即使在同一小鼠队列29,30。几年前，LIBERASE研究级酶，含有高度纯化的胶原酶和中性蛋白酶启动在胸腺组织离解30中使用。在这里，我们描述了一个LIBERASE消化为基础的协议，具有优化的机械分离过程，能产生大量的可行的TEC的小鼠胸腺组织。 。
为丰富分离的间质细胞，以前的研究中使用任何浓度梯度或磁珠分离21,29。然而，两种方法都导致严重的损失胸腺基质细胞，cTECs 29的特别是某些人口的人口。细胞毒性消除和平移技术<s达> 31,32已广泛用于消耗或淋巴细胞分离免疫领域12,31。这些技术的比较后，我们成立了目前的平移协议的TEC富集。在浓缩过程中的温和条件下会导致更少的细胞死亡和公正，提高TEC的恢复。
第3节中所描述的分离的胸腺细胞悬浮液可直接应用到流式细胞仪分析鉴定TEC的子集和树突状细胞和表征。第4节介绍了一个简单而有效的方法来确定使用多参数流式细胞仪TEC的子集。进行实验，寻求获得纯化的cTECs或mTECs，泰格丰富和细胞分选程序，可以在第5和第6被发现。
Protocol
Representative Results
Discussion
在协议中，关键步骤是准备胸腺基质细胞（第3节）和肾小管上皮的富集（第4节）。强烈建议新鲜酶溶液，每次准备和组织，尽快治疗。对于池thymi，优化的酶溶液的体积取决于thymi的数量是必需的。如果任何组织残留物的处理之后左，加入更多的酶溶液和延长温育时间可以提高细胞产量。中富集的TECs，完成收集上清液，并重复在第5.3节中概述将降低信元丢失的板冲洗。
1980?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由卫生部资助R01 AI088209（到KAH）国家机构的支持。我们也感谢明尼苏达流式细胞资源的大学。
Materials
| Anti-mouse EpCAM | eBioscience | XX-5791-YY* | Clone G8.8 |
| Anti-mouse MHC II | eBioscience | XX-5321-YY* | Clone M5/114.15.2 |
| Anti-mouse Ly51 | eBioscience | XX-5891-YY* | Clone 6C3 |
| UEA-1 | Vector Laboratory | FL-1061 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | LSRFortessa | |
| Flow cell sorter | BD Biosciences | FACSAria | |
| FACS tubes | BD Biosciences | 352052 | |
| Flow cytometry analysis software | TreeStar – Flowjo | FlowJo v7/9 | |
| *XX varies by fluorochrome and YY varies by vial size. |
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