هيدروجيل الجسيمات النانوية حصاد البلازما أو البول للكشف عن وفرة البروتينات منخفضة
Summary
Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.
Abstract
اكتشاف العلامات البيولوجية رواية يلعب دورا حاسما في توفير أكثر حساسية ومحددة كشف المرض. للأسف كثير من المؤشرات الحيوية منخفضة الوفرة التي توجد في السوائل البيولوجية لا يمكن الكشف عنها بسهولة مع مطياف الكتلة أو المناعية لأنها موجودة في تركيز منخفض جدا، هي عطوب، وغالبا ما يخفيها وفرة البروتينات عالية مثل الألبومين أو المناعي. الطعم تحتوي على بولي (N-isopropylacrylamide) (NIPAm) النانوية استنادا قادرة على التغلب على هذه الحواجز الفسيولوجية. في خطوة واحدة أنها قادرة على التقاط، والتركيز والحفاظ على المؤشرات الحيوية من سوائل الجسم. منخفضة الوزن الجزيئي التحاليل تدخل جوهر جسيمات متناهية الصغر وأسرت من قبل مختلف الأصباغ الكيميائية العضوية، والتي تكون بمثابة الطعم تقارب عالية البروتين. النانوية قادرة على تركيز البروتينات من الاهتمام من قبل عدة أوامر من حجمها. هذا العامل هو تركيز كاف لزيادة مستوى البروتين مثل أن البروتينات هي ضمنحد الكشف من الطيف الحالية الكتلة، النشاف الغربي، والمناعية. يمكن تحضين النانوية مع مجموعة كبيرة من السوائل البيولوجية وأنها قادرة على تخصيب كثيرا من تركيز البروتينات منخفضة الوزن الجزيئي والببتيدات مع استبعاد الزلال وغيرها من البروتينات عالية الوزن الجزيئي. تظهر بياناتنا أن 10،000 التضخيم أضعاف في تركيز الحليلة معين لا يمكن أن يتحقق، مما الطيفي والمناعية للكشف عن المؤشرات الحيوية لا يمكن الكشف عنها سابقا.
Introduction
على الرغم من الانتهاء من تسلسل الجينوم البشري، لم يتم إحراز تقدم كبير في تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية المرض مرحلة مبكرة، أو التي ترتبط مع نتائج علاجية، أو التكهن 1. وأحد أسباب ذلك عدم إحراز تقدم هو أن العديد من المؤشرات الحيوية الهامة المحتملة توجد بتركيز أقل من حد الكشف عن مطياف الكتلة التقليدية وغيرها من منصات اكتشاف العلامات البيولوجية. مطياف الكتلة (MS) ومتعددة رصد رد الفعل (MRM) لديهم حساسية الكشف عادة أكبر من 50 نانوغرام / مل في حين أن الغالبية العظمى من التحاليل المناعية تقاس في سقوط المختبر السريري في نطاق بين 50 جزء من الغرام / مل و 10 نانوغرام / مل . وهذا يعني أن العديد من المؤشرات الحيوية، وخاصة في المرحلة المبكرة من المرض لا يمكن الكشف عنها بواسطة MS التقليدية وMRM 2. وبالإضافة إلى ذلك وجود وفرة عالية من البروتينات مثل الألبومين والغلوبولين المناعي في السوائل البيولوجية المعقدة غالبا ما تخفي من مليار أضعاف مريض بالحبوفاق سطيف منخفضة وفرة، منخفضة الوزن الجزيئي البروتينات والببتيدات 3، 4، ولهذا السبب هناك حاجة العديد من الخطوات التحضيرية عينة قبل التسلسل الطيف الكتلي وتحديد الهوية. إحدى هذه خطوة تمهيدية توظف استنزاف البروتينات عالية فرة مع الأعمدة استنزاف المتاحة تجاريا 5-8. للأسف هذه الخطوة تؤدي إلى تخفيض العائد من المؤشرات الحيوية مرشح لأنها غالبا ما تكون مرتبطة تساهميا مع غير البروتينات الحاملة التي يتم إزالتها. ويمثل تحديا آخر من استقرار المؤشرات الحيوية مرشح فيفو السابقين مرة واحدة يتم جمع العينات. بروتينات قابلة للتحلل بواسطة البروتياز الذاتية أو الخارجية 9. يمكن النانوية هيدروجيل تجاوز هذه التحديات الحرجة عن طريق تضخيم تركيز العلامات البيولوجية المفترضة إلى مستوى ضمن نطاق الفحص، مع حماية البروتين من تدهور 10-13.
من المهم أن نلاحظ عشرفي LMW البروتينات في الدم هي مزيج من البروتينات سليمة الصغيرة وكذلك أجزاء كبيرة من البروتينات. البروتينات المشتقة من الأنسجة أكبر من 60 كيلو دالتون كبيرة جدا للدخول بشكل سلبي مجرى الدم من خلال الغشاء القاعدي الأوعية الدموية، ولكنها يمكن أن تمثل في الدم والببتيدات أو شظايا البروتين 14. هدفنا هو قياس المؤشرات الحيوية تعميم الرواية التي يمكن أن تكون مرشحة للكشف المبكر عن المرض، والطبقية المريض للعلاج، ومراقبة الاستجابة للعلاج. يتم إنشاء النانوية جهدنا لاستبعاد انتقائي المناعية وفرة عالية والزلال، في وقت واحد أثناء التقاط البروتينات والببتيدات الصغيرة والتركيز عليها ما يصل إلى 100 أضعاف اعتمادا على حجم انطلاق.
حددت مجموعتنا مجموعة من الأصباغ العضوية الصغيرة التي يمكن أن تعمل بنجاح تقارب عالية والطعوم الجزيئية للبروتينات والببتيدات. ويعتقد ملزم البروتين صبغ أن يكون نتيجة لمزيج من التفاعل مسعور وكهرباءق. الحلقات العطرية على صبغ تعشيق مع البروتينات عبر جيوب مسعور على سطح البروتين 11.
الطعوم، اعتمادا على الكيمياء، وتظهر تقارب معين لفئات مختارة من التحاليل. الطعوم تتنافس مع البروتينات الحاملة، مثل الزلال، على البروتينات أو الببتيدات. منخفضة الوزن الجزيئي البروتينات / الببتيدات تصبح المحاصرين في الجسيمات. يتم منع البروتينات عالية الوزن الجزيئي مثل الألبومين والغلوبولين المناعي من دخول الجسيمات بسبب القدرة النخل بسبب المسام تقييدا من هيدروجيل 11 (الشكل 1).
وقد تم تجميع الجسيمات النانوية هيدروجيل من قبل هطول البلمرة التي بدأها بيرسلفات الأمونيوم 11. N-isopropylacrylamide (NIPAm)، يسمح شارك أحادية من حمض الاكريليك (AAC) وآليلامين (AA) وعبر رابط N، N'-Methylenebisacrylamide (BIS) للرد على 70 درجة مئوية لمدة 6 ساعة في ظروف المخففة 11، 13، وتقارب نسبة عالية من البروتين ملزمة من بولي (N-isopropylacrylamide-CO-حمض الاكريليك) (بولي (NIPAm-CO-AAC) nanoparticlesis من خلال دمج تساهميا الأصباغ التي تحتوي على الأمينية (أي.، والأصباغ sulfonatedanthraquinonetriazine) في الجسيمات النانوية من خلال تحقيق رد فعل amidation أجريت في المذيبات المائية أو العضوية تبعا ل/ خصائص ماء مسعور من 11 الأصباغ، يستخدم 13. استبدال أليف النواة للمجموعات الأمينات في جسيمات متناهية الصغر مع ذرة كلور لصبغ anthraquinonetriazine لخلق بولي تحتوي على صبغة (NIPAm -co-آليلامين) (AA) النانوية 11، 12. يتم استغلال عملية البلمرة من خطوتين لخلق الجسيمات النانوية هيدروجيل تحتوي على الغلاف الخارجي من حمض vinylsulfonic (VSA) 11، 13.
النانوية هيدروجيل يمكن تطبيقها على السوائل البيولوجية المختلفة، بما في ذلك الدم الكامل، والبلازما، المصل، السائل النخاعي، والعرق، والبول. في خطوة واحدة، في الحل، نanoparticles إجراء سريع (في غضون دقائق) عزل وتركيز منخفض الوزن الجزيئي التحاليل 10، 11، 13، 15-18. ومزال البروتينات في وقت لاحق من الجسيمات النانوية والكشف باستخدام ويسترن النشاف 19-21، مطياف 10، 11، 13، 15، 18، 22 كتلة (23 عاما) المناعية / ELISA 10، 11، 15، 18، أو مرحلة عكس البروتين ميكروأري 16، 24 المقايسات. النانوية بين functionalized مع الطعم الكيميائية، وتقديم الأساسية أو الأساسية قذيفة الهندسة المعمارية، والتقاط وتركز البروتينات على أساس الخصائص الفيزيائية الطعم / شل. لذا سوف الأصباغ المختلفة دمجها في التقاط الجسيمات النانوية مجموعات فرعية مختلفة من البروتينات مع اختلاف الكفاءة على أساس تقارب صبغ، ودرجة الحموضة من الحل، وحضور / غياب المنافسة بروتينات عالية وفيرة 13. وعلاوة على ذلك، فإن كمية الجسيمات النانوية فيما يتعلق حجم الحل يؤثر على العائد البروتين من الجسيمات النانوية. هذه الجوانب منوأظهرت هيدروجيل حصاد جسيمات متناهية الصغر باستخدام ثلاثة جسيمات متناهية الصغر الطعوم المختلفة للبروتينات الحصاد من عينات البلازما التي تحتوي على كميات عالية من البروتين، وعينات من البول والتي عادة لا تحتوي على كميات كبيرة من البروتين. في هذا البروتوكول نظهر الحصاد والتركيز عامل نخر الورم ألفا (TNFα) من عينات البلازما باستخدام بولي (NIPAm-CO-AAC)، بولي (NIPAm / صبغ)، وقذيفة النانوية الحدقة (بولي (NIPAm-CO-VSA)) . وتظهر بولي (NIPAm / صبغ) الجسيمات النانوية للتركيز المستضد الأنواع المتفطرة التي تم إضافتها إلى عينات البول الإنسان، لتقليد السل المتفطرة الأفراد المصابين.
Protocol
Representative Results
Discussion
الصلة السريرية
ويعتقد أن المصل أو البلازما عينة لاحتواء منخفضة وفرة البروتينات والببتيدات المنتشرة التي يمكن أن توفر مصدرا غنيا للمعلومات عن حالة الكائن الحي ككل. على الرغم من الوعد البروتينات في الدم، وهناك ثلاثة حوا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
مايكل هنري، جامعة مدينة دبلن، يرجى المساعدة في جمع البيانات وتحليلها هو مبين في الشكل 5. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل (1) جامعة جورج ماسون، (2) الإيطالية IstitutoSuperiore دي سانيتا "في إطار ايطاليا / الولايات المتحدة الأمريكية اتفاقية تعاون بين وزارة الصحة والخدمات الإنسانية، جامعة جورج ماسون، والوزارة الإيطالية للصحة العامة، (3) NIH، برنامج المنح IMAT 1R21CA137706-01 و1R33CA173359-01 إلى LAL، و (4) سيريس العلوم النانوية، وشركة .
Materials
| hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50mM pH7.0 | VWR | IC816116 | 50mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| sodium thiocyanate 25mM | Acros Organics | 419675000 | for serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | for urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | use at room temperature to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | for serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50ml tube capacity, rcf 3700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | with screw caps for urine samples |
| 1.5ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Disposable plastic transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | at least 1ml capacity |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | seconds/minutes |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
- Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).
- Merrell, K., et al. Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry. J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).
- Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).
- Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood. Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).
- Geho, D., et al. Fractionation of serum components using nanoporous substrates. Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).
- Sennels, L., et al. Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads. J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer. J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).
- Marshall, J., et al. Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction. J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).
- Fredolini, C., et al. Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles. Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).
- Luchini, A., et al. Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation. Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).
- Patanarut, A., et al. Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).
- Tamburro, D., et al. Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers. J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
- Fredolini, C., et al. Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH. Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).
- Longo, C., et al. Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers. PLoS One. 4 (3), e4763 (2009).
- Luchini, A., et al. Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).
- Luchini, A., et al. Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals. J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Penna, A., Cahalan, M., , Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (7), 264 (2007).
- Bosch, J., et al. Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results. J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).
- Fredolini, C., et al. Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology. AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).
- Longo, C., et al. A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum. Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).
- Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).
- Douglas, T. A., et al. The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease. Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).
- Prakash, A., et al. Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies. J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).
- Choi, K. M., et al. Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease. Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).
- Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle. Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).
- Izycki, T., et al. Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy. Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).
- Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).
- Kitazume, S., et al. Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo. Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).
- Saito, T., et al. Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).
- Struyf, S., et al. PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).
- Michael, I. P., et al. Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression. J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).
