ハイドロゲルナノ粒子プラズマの収穫や少量のタンパク質を検出するための尿
Summary
Several pathological biomarkers cannot be easily detected by current techniques because of their low concentration in biological fluids, the presence of degrading enzymes, and large amounts of high molecular weight proteins. Chemically functionalized hydrogel nanoparticles can harvest, preserve and concentrate low abundance proteins enabling the detection of previously undetectable biomarkers.
Abstract
新規バイオマーカーの発見は、より高感度かつ特異的な疾患検出を提供する上で重要な役割を果たしている。それらは、非常に低濃度で存在する不安定であり、しばしば、アルブミンまたは免疫グロブリンのような高量のタンパク質によってマスクされるため、残念ながら、生物学的流体中に存在する多くの低存在量のバイオマーカーは、容易に、質量分析またはイムノアッセイを用いて検出することができない。ポリ（N-イソプロピルアクリルアミド）（NIPAM）ベースのナノ粒子を含有する餌は、これらの生理学的障壁を克服することができる。一工程において、それらは、捕捉し濃縮して、体液からのバイオマーカーを保持することができる。低分子量の分析物は、ナノ粒子のコアに入り、高親和性タンパク質ベイトとして作用する異なる有機化学色素によって捕捉される。ナノ粒子は、数桁目的のタンパク質を集中することができます。この濃縮係数は、タンパク質が範囲内にあるように、タンパク質レベルを増加させるのに十分である現在の質量分析計、ウェスタンブロッティング、および免疫アッセイの検出限界。ナノ粒子は、生物学的流体の過多とインキュベートすることができ、それらは、アルブミンおよび他の高分子量蛋白質を除外して大幅に低分子量タンパク質およびペプチドの濃度を豊かにすることができる。本発明者らのデータは、以前に検出できないバイオマーカーを検出するために質量分析および免疫アッセイを可能にする、特定の分析物の濃度の10,000倍の増幅が達成できることを示している。
Introduction
ヒトゲノムシークエンシングの完了にもかかわらず、かなりの進歩が早期の疾患の予測バイオマーカーの同定に行われていない、またはそれは、治療転帰または予後1と相関する。進歩の欠如の一つの理由は、多くの潜在的に重要なバイオマーカーが従来の質量分析法および他のバイオマーカー発見プラットフォームの検出限界未満の濃度で存在することがある。質量分析（MS）および多重反応モニタリング（MRM）は、分析物の大部分は50 pg / mlで、および10ng / mlの間の範囲の臨床検査秋にイムノアッセイによって測定しながら、ng / mlで50より典型的には検出感度を持つ。これは、特に疾患の早期段階における多くのバイオマーカーは、従来のMS及びMRM 2により検出できないことを意味する。さらに、このような複雑な生物学的流体中のアルブミンおよび免疫グロブリンのような高量のタンパク質の存在は、しばしば10億倍販売によってマスクエス低存在量、低分子量タンパク質およびペプチド3、図4に示すように 、このためいくつかのサンプル準備ステップは、質量分析配列決定および同定の前に必要とされる。そのような準備工程は、市販の空乏列5-8の高存在量タンパク質の枯渇を採用しています。それらはしばしば、非共有結合的に削除されるキャリアタンパク質と関連しているので、残念ながら、このステップは、候補バイオマーカーの歩留まりの低下につながる。サンプルが収集されると別の課題は、候補バイオマーカーex vivoでの安定性により表される。タンパク質は、内因性または外因性のプロテアーゼ9による分解を受けやすい。分解10-13からタンパク質を保護しながら、ヒドロゲルのナノ粒子は、アッセイの範囲内のレベルまでの推定バイオマーカーの濃度を増幅することにより、これらの重要な課題を超越することができる。
それは、目に注意することが重要ですLMWで血液中のタンパク質は、小さな完全なタンパク質だけでなく、大規模なタンパク質の断片の混合物である。 60kDaのより大きな組織由来のタンパク質は、受動的に、血管基底膜を通って血流に入るには大きすぎるが、それらはペプチドまたはタンパク質断片14として血液中に表すことができる。私たちの目標は、疾病の早期発見、治療のために患者の層別化、および治療に対する応答をモニターするための候補となり得る新規の循環バイオマーカーを測定することである。当社のナノ粒子は、同時により小さなタンパク質およびペプチドを捕捉し、出発容量に応じて、100倍にそれらを集中しながら、選択的に、高存在量の免疫グロブリンとアルブミンを除外するために作成されます。
当社グループは、成功し、タンパク質およびペプチドのための高親和性高分子の餌として作用することができる小さな有機色素のセットを同定した。タンパク質 – 色素結合、疎水性及び静電的相互作用の組合せに起因すると考えられているS。タンパク質表面11上の疎水性ポケットを経由してタンパク質と色素のインターリーブ上の芳香環。
餌は、それらの化学的性質に応じて、分析物の選択されたクラスに対して特定の親和性を示す。餌は、タンパク質またはペプチドを、アルブミンなどのキャリアタンパク質と競合する。粒子中に捕捉される低分子量タンパク質/ペプチド。例えば、アルブミンおよび免疫グロブリンなどの高分子量タンパク質に起因ヒドロゲル11（図1）の制限のため、細孔にふるい分け能力の粒子に侵入することを防止している。
ヒドロゲルのナノ粒子は、過硫酸アンモニウム11によって開始沈殿重合により合成される。 N-イソプロピルアクリルアミド（NIPAM）は、アクリル酸（AAC）およびアリルアミン（AA）及び架橋剤N、N'-メチレンビスアクリルアミド（BIS）のコモノマー、希釈条件1を 6時間70℃で反応させ1,13。共有結合を介してナノ粒子にアミノ基含有染料（ すなわち 、sulfonatedanthraquinonetriazine染料）を組み込むことによって達成ポリ親和性（N-イソプロピルアクリルアミド-コ-アクリル酸）（ポリ（NIPAM-コ-AAC）nanoparticlesis結合高タンパク質染料11、13の親水性/疎水性特性に依存して水性または有機溶媒中で実施アミド化反応。anthraquinonetriazine色素の塩素原子を有するナノ粒子中のアミン基の求核置換は、色素含有ポリ（NIPAMを作成するために利用されるコ-アリルアミン）（AA）は、11ナノ12。二段階の重合プロセスは、ビニルスルホン酸（VSA）11,13の外殻を含むヒドロゲルのナノ粒子を作成するために利用される。
ヒドロゲル粒子は、全血、血漿、血清、脳脊髄液、汗、および尿を含むさまざまな生物学的液体に適用することができる。ワンステップで、溶液中で、nはanoparticlesは（数分以内）急速隔離および低分子量の濃度は10、11、13、15-18分析物行う。タンパク質は、続いて19-21、質量分析法10、11、13、15、18、22、23、イムノアッセイ/ ELISA 10、11、15、18、または逆相タンパク質マイクロアレイ16を、ウェスタンブロッティング用いてナノ粒子から溶出し、検出され24アッセイ。化学餌で官能ナノ粒子と、コアまたはコアシェル·アーキテクチャを提示するには、餌/シェルの物理化学的特性に基づいてタンパク質を捕捉し、濃縮する。ナノ粒子に組み込まれた別の染料は、したがって、色素親和性に基づいて効率、溶液のpH、高濃度タンパク質13、競合の存在/不在を変化させて、タンパク質の異なるサブセットを捕捉するであろう。さらに、溶液の体積に対するナノ粒子の量は、ナノ粒子からのタンパク質収量に影響する。これらの態様のハイドロゲルナノ粒子収穫は、タンパク質を大量に含有して血漿サンプルから、典型的には大量のタンパク質を含まない尿サンプルからタンパク質を回収するための3つの異なるナノ粒子ベイトを用いて実証されている。このプロトコルでは、収穫およびポリ（NIPAM-コ-AAC）、ポリ（NIPAM /染料）、及びコア – シェル型ナノ粒子を用いて血漿サンプルからの腫瘍壊死因子α（TNFα）の濃縮を実証する（ポリ（NIPAM – コ – VSA）） 。ポリ（NIPAM /色素）のナノ粒子は、 結核菌感染個体を模倣するために、ヒト尿サンプルに添加したマイコバクテリウム種の抗原を濃縮することが示されている。
Protocol
Representative Results
Discussion
臨床的関連
血清または血漿試料は、全体としての生物体の状態に関する情報の豊富な供給源を提供することができる低存在量の循環タンパク質およびペプチドを含むと考えられる。血清プロテオミクスの約束にもかかわらず、臨床的有益性10、11、16、25にバイオマーカーの発見および翻訳を阻止3つの基本的かつ重大な生理学的障壁があります。
<…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
親切に図5に示すデータの収集と分析を支援し、マイケル·ヘンリー、ダブリン市立大学、。この作品は、（1）ジョージ·メイソン大学によって部分的にサポートされていた、イタリア/アメリカの枠組みの中で（2）イタリア語IstitutoSuperioreディ·サニ'米国保健社会福祉省、ジョージ·メイソン大学、公衆衛生のイタリア省、LAL〜（3）のNIH、IMATプログラム助成1R21CA137706-01と1R33CA173359-01、および（4）セレスナノサイエンス株式会社の間で協力協定。
Materials
| hydrogel nanoparticles | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP particles |
| 18 MΩ-cm water | Type 1 reagent grade water | ||
| Tris HCl, 50mM pH7.0 | VWR | IC816116 | 50mM, pH 7 |
| Acetonitrile | BDH | BDH1103-4LP | available from VWR |
| Ammonium Hydroxide NH4OH | BDH | BDH3014 | available from VWR, assayed at 28-30% NH3 |
| sodium thiocyanate 25mM | Acros Organics | 419675000 | for serum/plasma samples |
| Multi-analyte Urine Reagent Strips | Siemens | 2161 | for urine samples |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | use at room temperature to prevent SDS from precipitating |
| Dry bath incubator (100 oC) with heating block | Barnstead | 11-715-125DQ | do not substitute a boiling water bath |
| Nitrogen evaporator manifold | Organomation Associates | Microvap118 | for serum/plasma samples |
| Centrifuge, swing-out rotor | Sorvall | Legend series | 50ml tube capacity, rcf 3700 x g |
| Centrifuge, fixed angle rotor | Eppendorf | 5424 | 1.7ml microcentrifuge capacity, rcf 16,000 x g |
| 50ml conical centrifuge tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | with screw caps for urine samples |
| 1.5ml microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| Disposable plastic transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | at least 1ml capacity |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | 50-949-755 | |
| Timer | Fisher Scientific | S04782 | seconds/minutes |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
- Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (1), L16-L22 (2008).
- Merrell, K., et al. Analysis of low-abundance, low-molecular-weight serum proteins using mass spectrometry. J Biomol Tech. 15 (4), 238-248 (2004).
- Petricoin, E. F., Belluco, C., Araujo, R. P., Liotta, L. A. The blood peptidome: a higher dimension of information content for cancer biomarker discovery. Nat Rev Cancer. 6 (12), 961-967 (2006).
- Camerini, S., Polci, M. L., Liotta, L. A., Petricoin, E. F., Zhou, W. A method for the selective isolation and enrichment of carrier protein-bound low-molecular weight proteins and peptides in the blood. Proteomics Clin Appl. 1 (2), 176-184 (2007).
- Geho, D., et al. Fractionation of serum components using nanoporous substrates. Bioconjug Chem. 17 (3), 654-661 (2006).
- Sennels, L., et al. Proteomic analysis of human blood serum using peptide library beads. J Proteome Res. 6 (10), 4055-4062 (2007).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S. Analysis of the low molecular weight serum peptidome using ultrafiltration and a hybrid ion trap-Fourier transform mass spectrometer. J Chromatogr A. 1120 (1-2), 173-184 (2006).
- Marshall, J., et al. Processing of serum proteins underlies the mass spectral fingerprinting of myocardial infarction. J Proteome Res. 2 (4), 361-372 (2003).
- Fredolini, C., et al. Concentration and Preservation of Very Low Abundance Biomarkers in Urine, such as Human Growth Hormone (hGH), by Cibacron Blue F3G-A Loaded Hydrogel Particles. Nano Res. 1 (6), 502-518 (2008).
- Luchini, A., et al. Smart hydrogel particles: biomarker harvesting: one-step affinity purification, size exclusion, and protection against degradation. Nano Lett. 8 (1), 350-361 (2008).
- Patanarut, A., et al. Synthesis and characterization of hydrogel particles containing Cibacron Blue F3G-A. Colloids Surf A Physicochem Eng Asp. 362 (1-3), 8-19 (2010).
- Tamburro, D., et al. Multifunctional core-shell nanoparticles: discovery of previously invisible biomarkers. J Am Chem Soc. 133 (47), 19178-19188 (2011).
- Anderson, N. L., Anderson, N. G. The human plasma proteome: history, character, and diagnostic prospects. Mol Cell Proteomics. 1 (11), 845-867 (2002).
- Fredolini, C., et al. Nanoparticle technology: amplifying the effective sensitivity of biomarker detection to create a urine test for hGH. Drug Test Anal. 1 (9-10), 447-454 (2009).
- Longo, C., et al. Core-shell hydrogel particles harvest, concentrate and preserve labile low abundance biomarkers. PLoS One. 4 (3), e4763 (2009).
- Luchini, A., et al. Nanoparticle technology: addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. Curr Mol Med. 10 (2), 133-141 (2010).
- Luchini, A., et al. Application of Analyte Harvesting Nanoparticle Technology to the Measurement of Urinary HGH in Healthy Individuals. J Sports Med Doping Stud. 2 (6), (2012).
- Eslami, A., Lujan, J., Western, blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
- Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
- Penna, A., Cahalan, M., , Western Blotting using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris minigels. J Vis Exp. (7), 264 (2007).
- Bosch, J., et al. Analysis of urinary human growth hormone (hGH) using hydrogel nanoparticles and isoform differential immunoassays after short recombinant hGH treatment: preliminary results. J Pharm Biomed Anal. 85, 194-197 (2013).
- Fredolini, C., et al. Investigation of the ovarian and prostate cancer peptidome for candidate early detection markers using a novel nanoparticle biomarker capture technology. AAPS J. 12 (4), 504-518 (2010).
- Longo, C., et al. A novel biomarker harvesting nanotechnology identifies Bak as a candidate melanoma biomarker in serum. Exp Dermatol. 20 (1), 29-34 (2010).
- Luchini, A., Longo, C., Espina, V., Petricoin, E. F., Liotta, L. A. Nanoparticle technology: Addressing the fundamental roadblocks to protein biomarker discovery. J Mater Chem. 19 (29), 5071-5077 (2009).
- Douglas, T. A., et al. The use of hydrogel microparticles to sequester and concentrate bacterial antigens in a urine test for Lyme disease. Biomaterials. 32 (4), 1157-1166 (2010).
- Prakash, A., et al. Interlaboratory reproducibility of selective reaction monitoring assays using multiple upfront analyte enrichment strategies. J Proteome Res. 11 (8), 3986-3995 (2012).
- Choi, K. M., et al. Implication of lipocalin-2 and visfatin levels in patients with coronary heart disease. Eur J Endocrinol. 158 (2), 203-207 (2008).
- Hughes, A. D., Clunn, G. F., Refson, J., Demoliou-Mason, C. Platelet-derived growth factor (PDGF): actions and mechanisms in vascular smooth muscle. Gen Pharmacol. 27 (7), 1079-1089 (1996).
- Izycki, T., et al. Serum levels of IGF-I and IGF-II in patients with lung cancer during chemotherapy. Exp Oncol. 26 (4), 316-319 (2004).
- Jalosinski, M., Karolczak, K., Mazurek, A., Glabinski, A. The effects of methylprednisolone and mitoxantrone on CCL5-induced migration of lymphocytes in multiple sclerosis. Acta Neurol Scand. 118 (2), 120-125 (2008).
- Kitazume, S., et al. Molecular insights into beta-galactoside alpha2,6-sialyltransferase secretion in vivo. Glycobiology. 19 (5), 479-487 (2009).
- Saito, T., et al. Increase in hepatic NKT cells in leukocyte cell-derived chemotaxin 2-deficient mice contributes to severe concanavalin A-induced hepatitis. J Immunol. 173 (1), 579-585 (2004).
- Struyf, S., et al. PARC/CCL18 is a plasma CC chemokine with increased levels in childhood acute lymphoblastic leukemia. Am J Pathol. 163 (5), 2065-2075 (2003).
- Michael, I. P., et al. Human tissue kallikrein 5 is a member of a proteolytic cascade pathway involved in seminal clot liquefaction and potentially in prostate cancer progression. J Biol Chem. 281 (18), 12743-12750 (2006).
