Introduction
筋骨格系疾患は、米国および国や地域の保健システムの1のために存在深刻な結果に何百万人もの人々に影響を与えます。これらの疾患は、骨の損失および広範な治療および回復の長い期間を必要とする関節機能によって特徴付けられる。一般に、数および/ または骨粗鬆症および関節炎では、骨を吸収する破骨細胞特化し、細胞の活性の相対的増加が観察される2。生理学的条件下で破骨細胞の数および活性は、骨芽細胞により産生される核因子κ-Bリガンド(RANKL)の受容体活性化によって調節される。オステオプロテゲリン(OPG)、RANKLのためのデコイ受容体はまた、骨芽3によって生成される全身sRANKLの過剰発現、又はOPGの欠失を含むインビボ動物モデルは、骨粗しょう症の研究に非常に有用である。;しかしながら、これらの方法は、トランスジェニックマウス、4,5の発生を必要とする。ここでは、新たな代替筋骨格関連疾患の研究のためのsRANKLを過剰発現させる方法が記載されている。具体的には、ミニサークル(MC)DNA技術および流体力学的送達方法は、インビボで sRANKLの遺伝子導入を達成し、全身6マウスsRANKLを過剰発現するために使用した。
この方法はまた、低カルシウム食8により卵巣切除7および食事介入後の破骨細胞のホルモンの変調のような骨粗鬆症の他のin vivoモデルに対して相補的である。これらのモデルは、しかし、彼らは外科手術を必要とし、大幅なコスト9で、数ヶ月かかることがあり筋骨格関連障害のさまざまな側面を研究することは非常に便利です。卵巣摘出(OVX)げっ歯類モデルは卵巣の除去は、それによって人間の閉経後骨粗しょう症10を模倣するエストロゲン欠乏につながる実験動物モデルである。人間の閉経後骨粗しょう症、条件エストロゲン欠乏症encyは骨折のリスクの増加につながり、骨粗しょう症は、米国だけで約8万人の女性に影響を与えます。 OVXモデルは、閉経後の骨粗しょう症のために有用であるが、それは一般的に骨粗しょう症の研究に限定された利点を提供しています。エストロゲンは、したがって、その非存在下で破骨細胞活性の増加が観察される10〜12、破骨細胞を誘導し、骨芽細胞のアポトーシスを阻害することによって、骨損失を抑制する。骨吸収に有利RANKL-OPG比の不均衡13も観察される。しかしながら、 インビボでのエストロゲン欠乏はまた、を伴う成長因子β(TGFのβ)のレベルを減少させ、インターロイキン-7(IL-7)、TNF、IL-1およびIL-6 14,15が増加した。これらのサイトカインは、RANKL経路の骨リモデリングの調節機能が独立した知っていたとして、それは単に、RANKL-RANK軸に任意の破骨細胞活性化を帰属させることは不可能である。このホワイトペーパーで説明されたモデルは、VIVに留学する研究者を可能にしますO前炎症性サイトカインのない破骨細胞形成および骨量の減少におけるRANKL-RANK軸は、OVX齧歯類モデルと比較。
また、in vitroでの破骨細胞形成技術は、筋骨格疾患の潜在的な治療的処置のために、破骨細胞の活性化を研究するために不可欠なツールです。以前の研究は、マウスのマクロファージコロニー刺激因子(M-CSF)でマウス骨髄由来マクロファージ(BMMS)を培養し、マウスsRANKLが破骨細胞分化3,16,17につながることが示されている。ここで、マウスの骨髄から、ならびにインビトロ18ヒト末梢血単核細胞(PBMC)からの多核破骨細胞様細胞を生成するためのプロトコルが記載されている。成熟した終末分化して完全に機能する破骨細胞を定義するために必要な、細胞ベースのアッセイも簡単に説明している。これらのインビトロ技術は、生体内のアプローチで小説を補完し、一緒にPとして機能owerful調査ツールは、破骨細胞の分化および活性化を研究する。これらのシステムを使用して、科学者は、 インビボおよびインビトロで破骨細胞を生成し、それらの増殖および活性化に必要な刺激および信号を定義するだけでなく、薬理学的および生物学的阻害剤の有効性を試験することができる。
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Protocol
sRANKL MC DNAの1。流体力学的送達
- マウス尾静脈を介して流体力学的送達
- 尾静脈注射の前に、マウスを秤量する。リンゲル液中の希釈sRANKL又は緑色蛍光タンパク質(GFP)MC(37℃で予備加温)マウスの体重の約10%の総体積。
- 血管を拡張し、横方向の静脈LVS()が表示されるようにするために、注射の前に10分間ケージにマウスを温める。脱水と高体温を避けるために、慎重にマウスを監視します。
- とすぐのLVが拡張したと表示されているように、制止にマウスを移動し、動きを拘束するバレルに十分プラグを挿入します。このような呼吸などの正常な活動のためのマウスを監視します。必要に応じて、拘束具のプラグを調整します。
- 拭いてアルコールで尾の先端から注入領域3月4日を消毒。マウス尾静脈注射用の27〜30 Gの針を使用してください。片手でしっかりと尾を持ち、針を挿入尾静脈へ。注射器に圧力を適用し、5〜7秒以内に注入を完了します。
- 尾静脈から針を外し、出血を止めるために注射部位にコットンボールに圧力をかける。呼吸数は、通常の速度に低下した後、バックビバリウムにマウスを移動して、15〜30分間マウスを監視します。
- マウス血清TRACP5bはポスト遺伝子導入の全身マウスsRANKLの発現および定量の確認
- 血管を拡張と論理ボリュームが見えるようにするために5〜10分間ケージにマウスを温める。脱水と高体温を避けるために、慎重にマウスを監視します。
- 尾の先端からサイト1項のマウスの尾の刃で小さな切開を行います。
- 血清分離チューブ内の血液の約100μLを収集します。
- 30分間室温で血清分離管をインキュベートする。
- 5分間万×gで遠心分離サンプルと血清を収集します。 STORさらなる分析のために-80℃でのE血清。
- 市販のキットを用いて血清サンプルにsRANKL ELISAおよびマウス血清TRACP5bはアッセイを行う。
2マウス BMMSからin vitro破骨細胞世代で
- BMMSの単離と培養
- 脛骨および大腿骨の骨の単離:CO 2をドナーマウスを安楽死させると、70%エタノールで足を消毒。無傷で大腿骨と脛骨の骨を除去するために、踵骨の骨に恥骨から解剖。
- 骨を損傷することなく、慎重に皮膚や筋肉を取り外します。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含有するペトリ皿に処理し、大腿骨と脛骨を置く。
- 骨髄の除去:1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含有するα-MEMを装填し、大腿骨と脛骨の骨の一方の側に先端をカットし、25 G針を1ミリリットル注射器を用いて50ミリリットルチューブに骨髄を洗い流す(破骨細胞培養培地/ OCM)。
- マクロファージの文化
- 血球計または自動セルカウンターを用いて細胞を数える。
- プレート6ウェルプレート、ウェルあたり1×10 6個の細胞または96ウェルプレートに入れ、ガラス製カバースリップ(5mm)を又は象牙質切片に3×10 5個の細胞を、37℃でインキュベートする。
- 吸引物のすべてのメディアは、非接着細胞を含有し、48時間、25 ng / mlのマウスM-CSFを含有する新鮮なOCM(+)37℃で細胞をインキュベートする。
- 吸引物は、すべてのメディアと新鮮なOCM(+)メディアは、破骨細胞形成を開始する25 ng / mlのマウスのM-CSF、および30 ng / mLのマウスsRANKLを含む、37℃で細胞を培養する。必要に応じて、3日おきにメディアを補充する。
- 細胞を育てる約6〜8日間、骨を再吸収することのできる巨大な多核細胞を形成する。とすぐに多核細胞が出現するように、市販のキットを用いて染色し、TRAP(酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ)を行い、完全に成熟したときに、機能的アッセイを行う。ファロイジン染色および画像先に説明したように19、走査電子顕微鏡(SEM)によってスライスを象牙質に付着細胞を使用してカバースリップ上でF-アクチンを可視化リング。
ヒトPBMCから3。 インビトロ破骨細胞の生成
- ヒトPBMCを単離
- 50ミリリットルチューブに予め温めヒスト-1077の10ミリリットルを追加します。
- 空の白血球フィルターは50mlのチューブ(PBSで血液を1:1の比)中に滅菌PBSで血液バンクから得た。血がヒストと混合しないことを確認しながら、非常にゆっくりとヒストソリューションより希釈した血液をレイヤー。
- 18℃で20分間1000×gで遠心分離サンプルフォロー遠心ING、慎重に白血球および新しい50mlチューブへの転送を含む白色バフィーコート層を単離する。
- 細胞を回収し、5分間650×gで再度遠心PBSで細胞を希釈する。
- メディアや細胞カウンターを用いて細胞を数える - ()OCMで上清と再懸濁細胞を除去する。
- メッキおよび培養したPBMC
- OCMにおける細胞(+)培地およびプレート8×10 6細胞/ ml当たり6ウェルプレートまたは1×10 6細胞/ ml当たりに96ウェルプレートにウェル再懸濁する。免疫蛍光イメージングのため、ならびに骨吸収アッセイに適した骨切片上のカバーガラス(5mm)をプレート上の細胞を、必要に応じて以前に20に記載のように。
- 2〜3日毎に又は必要に応じてヒトM-CSFで細胞を補充変化培養培地。その後、OCMにおける25 ng / mlのヒトM-CSF(+)と一緒に、人間のsRANKLの30 ng / mlのを追加して5日目の分化のステップに進んでosteoclastogenesを開始するメディアです。
- 巨大多核細胞を形成するために約14〜21日間、細胞を増殖させる。できるだけ早く多核細胞が出現ように、これらの細胞は次いで、TRAPのために標識することができ、完全に成熟したときに、機能的アッセイを行うことができる。 F-アクチンリングはファロイジン染色を用いてカバーガラス上で可視化することができる。細胞形態は、SEMにより象牙質切片に付着した細胞において試験することができる。
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Representative Results
ここで、破骨細胞形成に対するサイトカインの効果を研究するための方法として、in vitroで破骨細胞への前駆細胞を分化するためのインビボおよび細胞培養プロトコルにおける破骨細胞の分化のための新規な遺伝子導入技術が記載されている。 図1では、マウスにおけるGFPおよびマウスsRANKL MCの成功した遺伝子導入の代表的な結果を示す。 図2において、マウス骨髄または明視野顕微鏡による破骨細胞への前駆細胞のヒトPBMC細胞分化経時培養物の代表的な画像が示されている。 図3、マウス骨髄由来の破骨細胞を特徴付けるための3つの独立した方法からの代表的な画像が示されている。マウスsRANKLの存在は、TRAPの発現( 図3AおよびB)およびF-アクチンリング( 図3CおよびD)の形成を活性化する。電気をスキャンするトロン顕微鏡(SEM)は、マウスsRANKL骨( 図3EおよびF)を再吸収することが可能な巨大細胞の形成を誘導することが明らかになった。 図4に、ヒトPBMC由来の破骨細胞の同じ特徴付け方法が示されている。
図1 sRANKL インビボ遺伝子転移が増加し、破骨細胞形成をもたらす。A、B)マウス肝臓外植片及びGFP又はsRANKL5μgのを注射した12週齢のC57BL / 6雄マウスのC、D)の全身像の前方ビューMCのDNA。矢印はGFP遺伝子導入マウスにおけるin vivoでの GFP発現を示している。 RANKL遺伝子導入マウスは全くバックグラウンド蛍光として機能する。マエストロ2イメージャ、1日後の遺伝子導入(赤と緑のDで撮影した画像enote背景とそれぞれGFP)、E)プラスミドの1、5で分析血清中のsRANKL MC-DNA構築物とF)sRANKLレベルのマップと11日は、GFPを投稿したり、sRANKL遺伝子導入。G)マウス血清TRACP5bはレベルが11日間に分析GFPまたはsRANKLの遺伝子導入後。スケールバーは、A、Bが5mm、及びC、D.が10mmを示す
マウスおよびヒトの細胞培養系の両方における図2 のインビトロ破骨細胞形成。分化を示した25 ng / mlのマウスM-CSFおよび30 ng / mlのマウスsRANKLの存在下で骨髄培養から単離されたマウス細胞の明視野顕微鏡法日目のタイムコースA)、2(b))5、およびC)8。単離されたヒト細胞の明視野顕微鏡末梢血および25 ng / mlのヒトM-CSFおよび日Dで分化の時間経過を示す30 ng / mlの人間sRANKL)、4、E)14、およびF)21の存在下で培養から。スケールバーは20μmで示している。
図3。生成とマウスの破骨細胞の特性骨髄から単離され、Aの存在下で6日間)培養マウス細胞の。TRAP染色(ピンク)25 ng / mlのマウスは、M-CSFまたはB)25 ng / mlのマウスM -CSFおよび30 ngの/ mlのマウスsRANKL。ファロイジン(緑色)および骨髄から単離し、Cの存在下において8日間)25 ng / mlのマウスM-CSF又はD)25 ng / mlのマウスM-CSFおよび30 ngのを培養マウス細胞のDAPI(青)染色ファの形成を示す/ mlのマウスsRANKL多核細胞内と接リング。骨髄およびEの存在下において8日間培養した)25 ng / mlのマウスM-CSFまたはF)の形成を示した25 ng / mlのマウスM-CSFおよび30 ng / mlのマウスsRANKLから単離されたマウス細胞のSEM顕微鏡写真矢印で示すように骨に吸収領域。スケールバーは、ADで40ミクロンを示し、E、Fの30ミクロン
Aの存在下で15日間培養したPBMCから単離されたヒト細胞)の図4。発生と人間の破骨細胞の特性評価。TRAP染色(ピンク)25 ng / mlのヒトM-CSFまたはB)25 ng / mlのヒトM- CSFおよび30 ng / mlの人間sRANKL。ファロイジン(緑)およびDAPI(青)Cの存在下で19日間培養したPBMCから単離されたヒト細胞の染色) 強い> 25 ng / mlのヒトM-CSFまたはD)多核細胞におけるF-アクチンリングの形成を示した25 ng / mlのヒトM-CSFおよび30 ng / mlの人間sRANKL。 Eの存在下で18日間のPBMC培養から単離されたヒト細胞)のSEM顕微鏡写真は、25 ng / mlのヒトM-CSFまたはF)25 ng / mlのヒトM-CSFおよび30 ng / mlの人間sRANKL吸収体の形成を示す矢印で示すように骨上の領域。スケールバーは、E、FのC、D、15ミクロン、20ミクロン、A、Bが10μmを示す
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Discussion
筋骨格条件は、罹患率と障害の原因をリードしているし、150以上の疾患や症候群で構成されます。今日は約90万人のアメリカ人に影響を与える。関節の炎症や骨の破壊性関節炎や骨粗しょう症などの筋骨格症状の主な機能です。骨粗しょう症は、多くの場合、骨の骨折につながる骨の整合性を弱める条件である。関節炎は腫れ、圧痛およびスティッフ制限通常の移動となり、障害につながることができ、関節の炎症を特徴とする慢性、衰弱させる病気です。筋骨格疾患の病因が大幅に互いに異なるが、骨破壊は、包括的な一般的な機能です。筋骨格状態における骨破壊は、主に、骨吸収と骨形成21,22との間の不均衡によって引き起こされる。一つの治療アプローチは、骨を破壊するこれらの細胞の能力を阻止しようとすることです、in vivoおよびin vitroの両方の破骨細胞の研究を可能にする。
ここで説明するin vivoモデルも導入遺伝子キャリア24として機能し、細菌の鎖から解放された小さなエピソームDNAベクター(〜4キロバイト)、アールミニサークルを使用しています。ミニサークルは数ヶ月まで安定した表情で、通常の細菌プラスミド、その後10〜1,000倍高い導入遺伝子を発現する。ミニサークルの小さい分子サイズは、より効率的なトランスフェクション率とかなりの発現が正常細菌プラスミド24と比較するために貢献しています。したがって、ミニサークルは、現在広く前臨床遺伝子導入研究25,26で適用される。流体力学的送達は、マウスの全身へのプラスミドDNAを提供するために毛細血管内の流体力学的圧力に基づいて十分に開発された手法である。マウスにおける尾静脈注射を介して肝細胞への流体力学的遺伝子送達は、十分に確立さtとOプラスミドDNA 6で導入遺伝子を発現する。これらの研究において、 インビボのマウスモデルにおいてマウスsRANKLを過剰発現は、sRANKL MCおよび尾静脈注射を介して流体力学的送達により達成される。マウスsRANKL ELISAは、マウスにおいてRANKLの血清レベルを検出するために使用することができる。マウス血清TRACP5bは、骨吸収マーカー27の有意な上昇はsRANKL遺伝子導入マウスで観察される。特に、この技術は、sRANKLの過剰発現に限定されるものではない。それはまた、他の分泌タンパク質28を過剰発現するように適用することができる。この手順の主な技術的な難しさは、尾静脈から流体力学的送達である。別に、通常の尾静脈注射から、流体力学的送達は5-7秒以内にマウスに生理的溶液を大量にミニサークルの配信を必要とします。このため、安定したハンドリングと注入技術は、この手順で成功するために不可欠です。 sRANKLトランスジェニックマウスを作製することは、生体内 osteocのための別のアプローチであるlastogenesis。しかしながら、sRANKL高レベルの胚致死4をもたらすことができるトランスジェニックマウスを作製することは、高価で時間がかかる。
OVXげっ歯類モデルにおいて、炎症、例えばTNF、IL-1およびIL-6などのサイトカインおよび非炎症性サイトカインsRANKLの両方がインビボ破骨細胞形成および骨喪失に寄与する。 sRANKL遺伝子導入モデルでは、非炎症性サイトカインsRANKLの過剰発現をもたらす。したがって、ここで説明sRANKLの遺伝子導入モデルでは、研究者に炎症がない状態で骨リモデリングにおけるRANKL-RANK軸の寄与を調べるための強力なツールを提供しています。
共培養骨髄細胞と骨芽細胞が関与in vitroで破骨細胞培養法は、前後半に1990年の29,30におけるRANKLの発見に、1980年代後半に設立されました。組換えM-CSFおよびRANKLが破骨細胞の分化を誘導し、効率的in vitroでの AND方法は、以前に他の研究3,31に記載されている。 M-CSFは、初期の破骨細胞前駆体32におけるRANK発現を刺激し、破骨細胞前駆体および成熟破骨細胞33のための生存因子として作用することが知られている。 RANKLは、破骨細胞の分化および活性化3に不可欠である。ここでは、 インビトロで破骨細胞形成する方法が記載されている。破骨細胞への正常な培養および前駆細胞の分化は、無菌の細胞の単離と適切なめっき技術だけでなく、タイミング細胞採取の慎重な理解が必要になります。破骨細胞分化は、破骨細胞前駆細胞の融合34を必要とし、破骨細胞前駆細胞の不十分な数が破骨細胞への前駆細胞の融合および分化を促進しないので、セルの計算されたメッキが重要である。同様に、破骨細胞前駆細胞の過剰な数は、形成および最終的な細胞死を凝集をもたらす。非の除去細胞を播種した後、接着細胞を2時間、最適な細胞数を維持するのに役立ちます。破骨細胞は、約48時間35の寿命と最終分化短命細胞であるように最後に、細胞採取の時間が非常に重要です。このように、細胞は多核細胞の最初の観測後48時間以内に採取しなければならない。次いで、これらの細胞は、TRAPを特徴とすることができ、免疫組織化学および骨吸収活性によってF-アクチン染色は、走査電子顕微鏡(SEM)によって検出することができる。これらの実験的アプローチは、それらの表現型と機能的に破骨細胞の明確な定義を可能にする。
インビボおよびここで説明するインビトロ技術における世界的な骨粗しょう症や関節リウマチの患者数百万人のための有効な治療戦略につながる、現在前臨床試験において、破骨細胞阻害剤の開発が容易になります。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
Human RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
Mouse RANK-Ligand - soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
References
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