Mesurer les flux d'éléments nutritifs et des substances toxiques minéraux dans les usines avec Traceurs radioactifs
Summary
In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.
Abstract
Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.
Introduction
L'absorption et la distribution des éléments nutritifs et les substances toxiques influencent fortement la croissance des plantes. En conséquence, l'étude des processus de transport sous-jacents constitue un domaine de recherche important en biologie végétale et en sciences agricoles de 1,2, en particulier dans les contextes d'optimisation nutritionnelle et les contraintes environnementales (par exemple, le stress salin, la toxicité de l'ammonium). Au premier rang des méthodes de mesure des flux dans les plantes est l'utilisation de traceurs radio-isotopiques, qui a été développé de manière significative dans les années 1950 (voir, par exemple, 3) et continue à être largement utilisé aujourd'hui. D'autres méthodes, telles que la mesure de l'épuisement des nutriments à partir du milieu de la racine et / ou l'accumulation dans les tissus, l'utilisation de micro-électrodes vibrants ions sélectifs tels que MIFE (microélectrode ion estimation du flux) et SIET (balayage de la technique de l'électrode sélective d'ions), et l'utilisation de colorants fluorescents ioniques spécifiques, sont également largement utilisés, mais ils sont limités dans leur capacité à détecter la grippe netxes (c'est à dire, la différence entre les flux et l'efflux). L'utilisation de radio-isotopes, d'autre part, permet au chercheur la capacité unique d'isoler et de quantifier les flux unidirectionnels, qui peut être utilisé pour régler les paramètres cinétiques (par exemple, K M et V max), et donner un aperçu de la capacité, énergétique, mécanismes et la régulation, des systèmes de transport. Mesures de flux unidirectionnels à base de radiotraceurs sont particulièrement utiles dans des conditions où le flux dans la direction opposée est élevé, et le chiffre d'affaires de piscines intracellulaires est rapide 4. En outre, les méthodes radiotraceurs permettent des mesures à effectuer en vertu des concentrations assez élevées de substrat, contrairement à beaucoup d'autres techniques (voir «Discussion», ci-dessous), parce que l'isotope tracé est observé sur un fond d'un autre isotope du même élément.
Ici, nous fournissons des instructions détaillées pour la mesure radio-isotopique de unidirectionnelle et nET flux de nutriments minéraux et des substances toxiques dans les plantes intactes. L'accent sera mis sur la mesure du flux de potassium (K +), un macro plante 5, et de l'ammoniac / ammonium (NH 3 / NH 4 +), un autre macronutriments qui est, cependant, toxique lorsqu'il est présent à des concentrations élevées (par exemple, 1 10 mM) 2. Nous allons utiliser les radio-isotopes 42 K + (t 1/2 = 12,36 h) et 13 NH 3/13 NH 4 + (t 1/2 = 9,98 min), respectivement, pour les plants intacts de l'orge du système de modèle (Hordeum vulgare L .), dans la description des deux principaux protocoles: afflux directe (DI) et analyse parcellaire par traceur efflux (CATE). Il faut noter d'emblée que cet article décrit simplement les étapes nécessaires pour effectuer chaque protocole. Le cas échéant, une brève explication des calculs et la théorie sont fournis, mais détaillées expositions de chaque techniqueLe contexte et la théorie de 'peuvent être trouvés dans plusieurs articles de fond sur le sujet 4,6-9. Fait important, ces protocoles sont largement transférables au flux analyse d'autres éléments nutritifs / substances toxiques (par exemple, 24 Na +, 22 Na +, 86 Rb +, 13 NO 3 -) et à d'autres espèces de plantes, mais avec quelques mises en garde (voir ci-dessous) . Nous soulignons également l'importance que tous les chercheurs travaillant avec des matières radioactives doivent travailler sous une licence arrangé par ionisants la réglementation de la sécurité de rayonnement de leur institution.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comme le montrent les exemples ci-dessus, la méthode de traceur radioactif est un puissant moyen de mesurer les flux unidirectionnels de nutriments et de substances toxiques in planta. Figure 1 montre que le NH 3 afflux peut atteindre plus de 225 pmol g -1 h -1, ce qui est peut-être le plus de bonne foi flux transmembranaire jamais enregistré dans un système de centrale 13, mais l'ampleur de ce flux ne serait pas visible si seulement …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400-mL glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1-mL pipette | Gilson | F144493 | |
| 10-mL pipette | Gilson | F144494 | |
| 1-mL pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10-mL pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
References
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