Flussi di minerali nutrienti e sostanze tossiche in misura Piante con traccianti radioattivi
Summary
In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.
Abstract
Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.
Introduction
L'assorbimento e la distribuzione di nutrienti e sostanze tossiche influenzano fortemente la crescita delle piante. Di conseguenza, l'indagine dei processi di trasporto sottostanti costituisce un'importante area di ricerca in biologia vegetale e scienze agrarie 1,2, soprattutto nei contesti di ottimizzazione nutrizionale e stress ambientali (ad esempio, stress salino, la tossicità di ammonio). Primo fra i metodi per la misurazione dei flussi nelle piante è l'uso di traccianti radioisotopici, che è stato sviluppato in modo significativo nel 1950 (si veda ad esempio, 3) e continua ad essere ampiamente usato oggi. Altri metodi, come la misurazione di esaurimento degli elementi nutritivi dal mezzo di root e / o l'accumulo nei tessuti, l'uso di microelettrodi vibranti ione-selettivi, come MIFE (microelettrodo ion stima di flusso) e SIET (scansione tecnica elettrodo ione-selettivo), e l'uso di coloranti fluorescenti ione-selettivo, sono anche ampiamente applicati, ma sono limitati nella loro capacità di rilevare l'influenza nettassi (cioè, la differenza tra afflusso e l'efflusso). L'uso di radioisotopi, dall'altro, consente al ricercatore la capacità unica di isolare e quantificare flussi unidirezionali, che può essere utilizzato per risolvere parametri cinetici (ad esempio, K M e V max), e fornire una conoscenza della capacità, energetica, meccanismi e regolazione, dei sistemi di trasporto. Misure di flusso unidirezionali realizzati con radiotraccianti sono particolarmente utili in condizioni in cui il flusso nella direzione opposta è alto, e il fatturato delle piscine intracellulari è rapida 4. Inoltre, i metodi radiotracciante consentono misurazioni condotte sotto concentrazioni piuttosto elevate di substrato, a differenza di molte altre tecniche (vedi 'Discussione', qui di seguito), perché l'isotopo tracciato si osserva su uno sfondo di un altro isotopo dello stesso elemento.
Qui, forniamo la procedura dettagliata per la misurazione di radioisotopi unidirezionale e net flussi di nutrienti minerali e di sostanze tossiche nelle piante intatte. L'accento verrà effettuato sulla misurazione del flusso di potassio (K +), un impianto di macronutrienti 5, e ammoniaca / ammonio (NH 3 / NH 4 +), un'altra macronutrienti che è, tuttavia, tossici se presenti a concentrazioni elevate (ad esempio, 1- 10 mM) 2. Useremo i radioisotopi 42 K + (t mezzo = 12.36 ore) e 13 NH 3/13 NH 4 + (t 1/2 = 9,98 min), rispettivamente in piantine intatte del orzo sistema modello (Hordeum vulgare L .), nella descrizione dei due protocolli principali: afflusso diretta (DI) e l'analisi compartimentale da tracciante efflusso (CATE). Dobbiamo notare fin dall'inizio che questo articolo descrive semplicemente i passaggi necessari per eseguire ogni protocollo da. Se del caso, brevi spiegazioni dei calcoli e la teoria sono forniti, ma dettagliate esposizioni di ogni tecnica'S sfondo e la teoria si possono trovare in diversi articoli importanti sull'argomento 4,6-9. È importante sottolineare che questi protocolli sono ampiamente trasferibili ad flux analisi di altri nutrienti / sostanze tossiche (ad esempio, 24 Na +, 22 Na +, Rb + 86, 13 NO 3 -) e di altre specie di piante, anche se con qualche distinguo (vedi sotto) . Sottolineiamo inoltre l'importanza che tutti i ricercatori che lavorano con materiali radioattivi devono lavorare sotto una licenza organizzato tramite ionizzanti regolatore di sicurezza di radiazione della loro istituzione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Come dimostrato negli esempi precedenti, il metodo radiofarmaco è un potente mezzo di misurare flussi unidirezionali di nutrienti e sostanze tossiche in planta. Figura 1 mostra che NH 3 afflusso può raggiungere superiore a 225 micromol g -1 h -1, che è forse la più alto bona fide flusso transmembrana mai riportato in un sistema impiantistico 13, ma la grandezza di questo flusso non sarebbe visibile se sono stati misurati solo i flussi net…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400-mL glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1-mL pipette | Gilson | F144493 | |
| 10-mL pipette | Gilson | F144494 | |
| 1-mL pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10-mL pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
References
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