Radyoaktif izleyiciler ile Bitkilerde Mineral Besin ve Toksikantların Değişimler Ölçme
Summary
In planta measurement of nutrient and toxicant fluxes is essential to the study of plant nutrition and toxicity. Here, we cover radiotracer protocols for influx and efflux determination in intact plant roots, using potassium (K+) and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) fluxes as examples. Advantages and limitations of such techniques are discussed.
Abstract
Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. Radioisotope tracing is a major technique used to measure such fluxes, both within plants, and between plants and their environments. Flux data obtained with radiotracer protocols can help elucidate the capacity, mechanism, regulation, and energetics of transport systems for specific mineral nutrients or toxicants, and can provide insight into compartmentation and turnover rates of subcellular mineral and metabolite pools. Here, we describe two major radioisotope protocols used in plant biology: direct influx (DI) and compartmental analysis by tracer efflux (CATE). We focus on flux measurement of potassium (K+) as a nutrient, and ammonia/ammonium (NH3/NH4+) as a toxicant, in intact seedlings of the model species barley (Hordeum vulgare L.). These protocols can be readily adapted to other experimental systems (e.g., different species, excised plant material, and other nutrients/toxicants). Advantages and limitations of these protocols are discussed.
Introduction
Besin ve Toksik maddelerin alımı ve dağıtımı kuvvetle bitki büyümesini etkilemektedir. Buna göre, yatan taşıma süreçlerinin incelenmesi, özellikle beslenme optimizasyonu ve çevresel streslere bağlamlarda, bitki biyolojisi araştırma ve tarımsal bilimler 1,2 önemli bir alanı teşkil (örneğin, tuz stresi, amonyum toksisitesi). Bitkilerde akılarının ölçülmesi için yöntemler arasında baş önemli 1950'lerde geliştirilmiş radyo-izotopik izleyiciler, kullanımı ve günümüzde yaygın olarak kullanılan olmaya devam etmektedir (3, örneğin, bakınız). Bu Mife (akı tahmini iyon mikroelektrot) ve SIET (tarama iyon seçici elektrot tekniği) ve kullanımı gibi dokularda kök orta ve / veya birikim, iyon seçici titreşimli mikroelektrot kullandığı için besin tüketme ölçümü gibi diğer yöntemler, İyon seçici floresanlı boyalar, ayrıca yaygın olarak uygulanır, ancak ağ grip tespit etmek için yetenekleri açısından sınırlıdırxes (örneğin, akışı ve dışarıya akış arasındaki fark). Radyoizotopların kullanılması, diğer taraftan, araştırmacı kinetik parametreleri çözmek için kullanılabilecek tek yönlü akıları izole etmek ve ölçmek için eşsiz bir yeteneği sağlar (örneğin, K, M ve V maks) ve kapasitesi hakkında bilgi sağlar, enerjisi, ulaşım sistemlerinin mekanizmaları ve düzenlenmesi,. Radyo-ile yapılan tek yönlü akış ölçümleri ters yönde akış kadar koşullar altında özellikle yararlı olan, hücre içi ve havuzlarının devir hızla 4'tür. Takip izotop, aynı elemanın diğer bir izotopun bir arka planı görülmektedir çünkü Ayrıca, Radyoaktif yöntemleri, (aşağıda, "Tartışma bakınız) ölçümlerinin bir çok diğer tekniklerin aksine, oldukça yüksek bir substrat konsantrasyonlarında iletilmesine olanak tanımaktadırlar.
Burada, tek yönlü ve n radyoizotopik ölçümü için ayrıntılı adım sağlayansağlam Bitkilerde ve mineral besin tozları ve toksik maddeler. Vurgu akı potasyum (K +) ölçülmesi, bir bitki makro besinin 5 ve amonyak / amonyum yapılacaktır (NH3 / NH4 +), ancak, örneğin, yüksek konsantrasyonlarda (en mevcut olduğu zaman toksik olan başka bir makro besin, 1- 10 mM) 2. Bu radyoizotoplar 42 K + (t 1/2 = 12,36 saat) ve 13 NH 3/13 NH4 + (t 1/2 = 9,98 dakika), sırası ile, bir model sistem arpa sağlam fidelerinde (Hordeum vulgare L. kullanacak .), iki temel protokollerin açıklaması: tracer efflux (CATE) tarafından doğrudan akını (DI) ve kompartman analizi. Biz bu makalede sadece her protokol gerçekleştirmek için gerekli adımları açıklar başından itibaren dikkat etmelisiniz. Her tekniğin uygun, hesaplamalar ve teorinin kısa açıklamalar sağlanan, ancak ayrıntılı edilir Fuarlarımız'S arka plan ve teori konuyla 4,6-9 birkaç önemli makalelerinde bulunabilir. Daha da önemlisi, bu protokoller diğer besin maddeleri / toksik maddelerin analizi akı genel olarak aktarılabileceği (örneğin, 24, Na +, 22, Na +, Rb + '86, 13 NO 3 -) ve diğer bitki türlerine, birkaç uyarılar da olsa (aşağıya bakınız) . Biz de radyoaktif maddeler ile çalışan tüm araştırmacıların kurumun iyonizan radyasyon güvenliği regülatörü ile düzenlenmiş bir lisans altında çalışması gerekir önemini vurguluyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıdaki örneklerde gösterildiği gibi, yöntem, in planta Radyoaktif besin ve toksik maddelerin tek yönlü akıyı ölçen bir güçlü bir araçtır. 1 NH3 akışı, belki de bir 225 umol g-1 st -1, aşan ulaşabileceği göstermektedir En iyi niyetli transmembran akı Hiç bir bitki sisteminde 13 bildirilmiştir, ancak net tozları ölçüldü, bu akının büyüklüğü görünür olmaz. NH3 büyük bir a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), the Canada Research Chair (CRC) program, and the Canadian Foundation for Innovation (CFI).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Gamma counter | Perkin Elmer | Model: Wallac 1480 Wizard 3" | |
| Geiger-Müller counter | Ludlum Measurements Inc. | Model 3 survey meter | |
| 400-mL glass beakers | VWR | 89000-206 | For pre-absorption, absorption, and desorption solutions |
| Glass funnel | VWR | 89000-466 | For efflux funnel |
| Large tubing | VWR | 529297 | For efflux funnel |
| Medium tubing | VWR | 684783 | For bundling |
| Small tubing | VWR | 63013-541 | For aeration |
| Aeration manifold | Penn Plax Air Tech | vat 5.5 | To control/distribute pressurized air into solutions |
| Glass scintillation vials | VWR | 66022-128 | For gamma counting |
| Glass centrifuge tubes | VWR | 47729-576 | For spin-drying root samples |
| Kimwipes | VWR | 470173-504 | For spin-drying root samples |
| Dissecting scissors | VWR | 470001-828 | |
| Forceps | VWR | 470005-496 | |
| Low-speed clinical centrifuge | International Equipment Co. | 76466M-4 | For spin-drying root samples |
| 1-mL pipette | Gilson | F144493 | |
| 10-mL pipette | Gilson | F144494 | |
| 1-mL pipette tips | VWR | 89079-470 | |
| 10-mL pipette tips | VWR | 89087-532 | |
| Analytical balance | Mettler toledo | PB403-S/FACT |
References
- Kronzucker, H. J., Coskun, D., Schulze, L. M., Wong, J. R., Britto, D. T. Sodium as nutrient and toxicant. Plant Soil. 369, 1-23 (2013).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. NH4+ toxicity in higher plants: a critical review. J. Plant Physiol. 159, 567-584 (2002).
- Epstein, E. Mechanism of ion absorption by roots. Nature. 171, 83-84 (1953).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Can unidirectional influx be measured in higher plants? A mathematical approach using parameters from efflux analysis. New Phytol. 150, 37-47 (2001).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Cellular mechanisms of potassium transport in plants. Physiol. Plant. 133, 637-650 (2008).
- Walker, N. A., Pitman, M. G., Lüttge, U., >Pitman, M. .. G. Measurement of fluxes across membranes. Encyclopedia of plant physiology. 2 Part A, (1976).
- Kronzucker, H. J., Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M. Analysis of 13NH4+ efflux in spruce roots – A test case for phase identification in compartmental analysis. Plant Physiol. 109, 481-490 (1995).
- Siddiqi, M. Y., Glass, A. D. M., Ruth, T. J. Studies of the uptake of nitrate in barley. 3. Compartmentation of NO3-. J. Exp. Bot. 42, 1455-1463 (1991).
- Lee, R. B., Clarkson, D. T. Nitrogen-13 studies of nitrate fluxes in barley roots. 1. Compartmental analysis from measurements of 13N efflux. J. Exp. Bot. 37, 1753-1767 (1986).
- Coskun, D., Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Regulation and mechanism of potassium release from barley roots: an in planta 42K+ analysis. New Phytol. 188, 1028-1038 (2010).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J., Maathuis, F. .. J. .. M. .. ,. Fluxes measurements of cations using radioactive tracers. Plant Mineral Nutrients: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. Volume 953, 161-170 (2013).
- Meeks, J. C., Knowles, R. ,., Blackburn, T. .. H. 13N techniques. Nitrogen isotope techniques. , 273-303 (1993).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Becker, A., Kronzucker, H. J. Rapid ammonia gas transport accounts for futile transmembrane cycling under NH3/NH4+ toxicity in plant roots. Plant Physiol. 163, 1859-1867 (2013).
- Coskun, D., Britto, D. T., Li, M., Oh, S., Kronzucker, H. J. Capacity and plasticity of potassium channels and high-affinity transporters in roots of barley and Arabidopsis. Plant Physiol. 162, 496-511 (2013).
- Johansson, I., et al. External K+ modulates the activity of the Arabidopsis potassium channel SKOR via an unusual mechanism. Plant J. 46, 269-281 (2006).
- Nocito, F. F., Sacchi, G. A., Cocucci, M. Membrane depolarization induces K+ efflux from subapical maize root segments. New Phytol. 154, 45-51 (2002).
- Wang, M. Y., Glass, A. D. M., Shaff, J. E., Kochian, L. V. Ammonium uptake by rice roots. 3. Electrophysiology. Plant Physiol. 104, 899-906 (1994).
- Walker, D. J., Leigh, R. A., Miller, A. J. Potassium homeostasis in vacuolate plant cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 10510-10514 (1996).
- Holm, L. M., et al. NH3 and NH4+ permeability in aquaporin-expressing Xenopus oocytes. Pflugers Archiv. Eur. J. Physiol. 450, 415-428 (2005).
- Britto, D. T., Kronzucker, H. J. Trans-stimulation of 13NH4+ efflux provides evidence for the cytosolic origin of tracer in the compartmental analysis of barley roots. Funct. Plant Biol. 30, 1233-1238 (2003).
- Malagoli, P., Britto, D. T., Schulze, L. M., Kronzucker, H. J. Futile Na+ cycling at the root plasma membrane in rice (Oryza sativa L.): kinetics, energetics, and relationship to salinity tolerance. J. Exp. Bot. 59, 4109-4117 (2008).
- Kronzucker, H. J., Britto, D. T. Sodium transport in plants: a critical review. New Phytol. 189, 54-81 (2011).
