Generatie van transgene<em> Hydra</em> Door Embryo Microinjection

Summary

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Abstract

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology¹. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Introduction

Hydra is gebruikt voor regeneratie, patroonvorming bestuderen en stamcellen ongeveer 250 jaar ² Hydra een eenvoudige body opgesteld met drie cellijnen. Ectodermale epitheel, endodermale epitheliale en interstitiële. Het buisvormige lichaam wordt gevormd door de ectodermale en endodermale epitheliale lijnen, die elk een enkele cellaag. Alle epitheliale cellen in de kolom lichaam mitotische. Wanneer epitheelcellen verplaatst naar de uiteinden ^3, de kop (mond en tentakels) aan het einde orale of voet (basale schijven) op aboral zij daartoe arresteren in de G2 fase van de celcyclus en veranderen lot van de cel ^4. De cellen van het interstitiële lineage verblijf op de tussenruimten tussen de epitheelcellen. Deze lijn wordt ondersteund door multipotente stamcellen die zich in het ectodermale epitheliale laag van het lichaam kolom ^5. De interstitiële stamcellen leiden tot drie somatische cell types (zenuwen, klier cellen, en nematocytes) en de kiemcellen ^6,7.

Als lid van de phylum Cnidaria, de zuster groep om alle bilateria, Hydra kan licht werpen op fundamentele biologische processen verdeeld onder meercellige dieren. Tot voor kort werden deze pogingen belemmerd door het gebrek aan betrouwbare methoden voor de verstoring van de genfunctie. Echter, met de ontwikkeling van transgene methodologie ^1, we zijn nu in staat om optimaal te profiteren van Hydra tot een beter begrip van de fundamentele mechanismen gebruikelijk om meercellige dieren, zoals stamcel functie, regeneratie, en patroonvorming krijgen. Hydra Transgene lijnen worden vastgesteld door injectie van plasmide DNA in embryo, wat resulteert in willekeurige integratie en chimere expressie in een aanzienlijke frequentie van jongen. Een lijn uniforme expressie in een bepaalde lijn kan worden vastgesteld door ongeslachtelijke voortplanting. Het vermogen om klonale vermeerderen transgenic Hydra lijnen is een voordeel boven de meeste diermodellen, die kan worden vermeerderd alleen geslachtelijke voortplanting. Bovendien kunnen transgene cellen gemakkelijk in vivo worden gevolgd door de transparantie van het dier en de afwezigheid van endogene fluorescerende eiwitten ^8.

In de zeven jaar sinds de eerste transgene Hydra lijnen werden ^1, dergelijke lijnen zijn gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen. Expressie van proteïnen verschillende celtypen is het mogelijk om celbeweging te volgen, veranderingen in celvorm waarnemen en volgen celtypes zowel wildtype omstandigheden en na chemische verstoring ^1,5,9-12. Bovendien expressie van verschillende proteïnen de diverse lineages maakt FACS isolatie van specifieke celpopulaties. Deze techniek is gebruikt voor het sequencen van stamcellen specifiek mRNA en afstammings-specifieke RNA's ^13,14. Terwijl de promotor vaneen van de twee Hydra actinegenen is meest gebruikt, enkele celtype specifieke promotors geïdentificeerd en gebruikt om expressie van GFP rijden transgene Hydra ^9,11,15,16. In de toekomst zal celtype specifieke promotors zorgen voor waarneming en verzameling van specifieke celtype. Bovendien werd een transgene benadering succes gebruikt om de cis-werkende regulerende elementen van de promoter Wnt3 ¹⁷ definiëren.

De ontwikkeling van transgene werkwijzen Hydra biedt een robuuste benadering voor het testen van de functie van genen door ectopische expressie, overexpressie en knockdown. Transgene dieren gemaakt die fluorescent-gemerkte eiwitten tot expressie teneinde zowel de functie en cellulaire lokalisatie ^18-20 onderzocht. Daarnaast is de expressie van RNA haarspelden in de 3'UTR van een GFP-transgen leidt tot knockdown van doelgenen ^21,22. In deze benaderingen GFP moet identificerenen volgen de transgene weefsel tijdens de creatie van de transgene lijn. Het is echter waarschijnlijk dat in sommige gevallen de GFP molecuul zou interfereren met de functie van het gecodeerde eiwit. Een recente studie toont aan dat Hydra genen kan worden geregeld in een operon configuratie, dwz polycistronische transcripten gemaakt, die vervolgens worden gescheiden door trans-spliced ​​leader toevoeging afzonderlijk ²³ vertaald. Door een gen dat codeert voor een eiwit of een RNA haarspeld in de stroomopwaartse positie van een operon en een fluorescent eiwit gen in de stroomafwaartse positie, kan een transgeen weefsel te volgen zonder het gen dat voor het eiwit of RNA haarspeld taggen. Deze werkwijze is gebruikt om een RNA haarspeld in een operon configuratie met DsRed2 drukken om te komen gen knockdown ^14.

Protocol

1 Voorbereiding van plasmide DNA, naalden en injectie Gerechten Bereid het plasmide-DNA met behulp van een High Speed ​​Maxi of Midi kit en concentreer het DNA tot 2,5 mg / ml met ethanol precipitatie. De DNA pellet moet worden opgelost in nuclease-vrij gedeïoniseerd water. Bewaar het DNA in 10-20 pi aliquots bij -20 ° C. (Zie Aanvullende tabel 1 voor een overzicht van beschikbare vectoren) Een injectie schotel middels agarose een trog construeren voor het vasthouden van embry…

Representative Results

Oprichting van transgene Hydra lijnen Feed transgene jongen om de 2-3 dagen met Artemia naupliën. Hatchlings soms niet eten voor een dag of twee na het uitkomen. Sommige nieuwe jongen zal nooit eten, en dus zal het niet overleven. Als het jong is transgene in ofwel de ectodermale (Figuur 1A) of endodermaal epitheelweefsel, zodat het dier uit te lopen en het verzamelen van de knoppen die de meeste transgene weefsel (Figuur 1B, C) ​​te hebb…

Discussion

Hydra reproduceert routinematig ongeslachtelijk, maar vereist prikkels uit de omgeving naar de productie van gameten beginnen. Deze stimuli zijn niet goed gedefinieerd voor de meeste Hydra soorten en kunnen van stam tot stam. Een belangrijke hindernis voor de productie van transgene Hydra is het verkrijgen van embryo's regelmatig omdat het moeilijk in een laboratoriumomgeving te induceren Hydra seksuele thuis hoort. De AEP stam ²⁵ echter produceert gameten gemakkelijk i…

Materials

AEP Hydra Strain	NA	NA	Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petri Dishes	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjection Fish Mold	IBI Scientific	FM-600
Borosilicate Glass with Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Phenol Red	Sigma	P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5	Sigma	F6521
Scalpel Blade #15	Fisher	50-822-421
Mineral oil	Sigma	M8410-500ML
Microinjector	Narishige	IM-9B
Magnetic Stand	Narishige	GJ-1
Iron Plate	Narishige	IP
Joystick Micromanipulator	Narishige	MN-151