La génération d'transgénique<em> Hydra</em> Par micro-injection d'embryons

Summary

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Abstract

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology¹. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Introduction

Hydra a été utilisée pour étudier la régénération, la formation de structures, et les cellules souches pour environ 250 ans ² Hydra a un plan de corps simple composé de trois lignées cellulaires:. Épithélial ectodermique, endodermique épithéliale et interstitielle. Le corps tubulaire est formé par la ectodermiques et endodermiques lignées épithéliales, dont chacun est une couche cellulaire unique. Toutes les cellules épithéliales de la colonne de corps sont mitotique. Lorsque les cellules épithéliales sont déplacés dans les extrémités ^3, la tête (bouche et les tentacules) à l'extrémité buccale ou le pied (disque de base) à la fin aborale, ils arrêtent dans la phase G2 du cycle cellulaire et de changer le destin des cellules ^4. Les cellules de la lignée interstitiel se trouvent dans les interstices entre les cellules epitheliales. Cette lignée est supporté par des cellules souches multipotentes qui sont situés dans la couche épithéliale de la colonne ectodermique du corps ^5. Les cellules souches interstitielles donnent naissance à trois cel somatiquel (les nerfs, les types de cellules de la glande, et nématocytes) et les cellules germinales ^6,7.

En tant que membre de l'embranchement des cnidaires, le groupe frère de tous bilaterians, Hydra peut faire la lumière sur les processus biologiques fondamentaux communs chez les animaux multicellulaires. Jusqu'à récemment, ces efforts ont été entravés par le manque de méthodes fiables pour la perturbation de la fonction des gènes. Cependant, avec le développement de la méthodologie transgénique ^1, nous sommes maintenant en mesure de profiter pleinement de Hydra à acquérir une meilleure compréhension des mécanismes de base communs aux animaux multicellulaires, tels que la fonction des cellules souches, la régénération et la structuration. Hydra lignées transgéniques sont créées par l'injection d'ADN plasmidique dans des embryons, ce qui conduit à une intégration aléatoire et d'expression chimère selon une fréquence importante des nouveau-nés. Une ligne avec une expression uniforme dans une lignée particulière peut être établie par multiplication asexuée. La capacité à se propager par clonage Transgenic Hydra lignes est un avantage par rapport à la majorité des modèles animaux, que l'on peut propager que par reproduction sexuée. En outre, les cellules transgéniques peuvent être facilement suivis in vivo en raison de la transparence de l'animal et de l'absence de protéines fluorescentes endogènes ^8.

Au cours des sept années écoulées depuis les premières lignes Hydra transgéniques ont été faites ^1, ces lignes ont été utilisés pour une variété d'applications. L'expression de protéines fluorescentes dans différents types de cellules a permis de suivre le mouvement des cellules, observer les changements dans la forme des cellules, et de suivre le destin des cellules à la fois dans des conditions de type sauvage et après perturbation chimique ^1,5,9-12. En outre, l'expression de protéines fluorescentes différentes dans les différentes lignées pour FACS permet l'isolement de populations de cellules spécifiques. Cette technique a été utilisée pour le séquençage des ARNm spécifiques de cellules souches de lignée spécifique et de petits ARN ^13,14. Bien que le promoteur del'un des deux gènes d'actine Hydra a été le plus largement utilisé, un des promoteurs spécifiques peu de type de cellule ont été identifiés et utilisés pour diriger l'expression de la GFP dans transgénique Hydra ^9,11,15,16. Dans le futur, les promoteurs spécifiques du type cellulaire permettront l'observation et la collecte de tout type de cellule spécifique. En outre, une approche transgénique a été utilisé avec succès pour définir les éléments régulateurs agissant en cis du promoteur WNT3 ^17.

Le développement de méthodes transgéniques à Hydra fournit une approche robuste pour tester la fonction des gènes par l'expression ectopique, la surexpression et démontable. Les animaux transgéniques ont été faites qui expriment des protéines étiquetées par fluorescence afin d'examiner à la fois la fonction et la localisation cellulaire ^18-20. En outre, l'expression d'épingles à cheveux d'ARN dans la région 3'UTR d'un transgène de la GFP conduit à knockdown de gènes cibles ^21,22. Dans ces approches GFP est nécessaire pour identifieret suivre le tissu transgénique lors de la création de la lignée transgénique. Cependant, il est probable que dans certains cas, la molécule de GFP interférerait avec la fonction de la protéine marquée. Une étude récente démontre que les gènes Hydra peuvent être disposés dans une configuration de l'opéron, c'est à dire, la transcription polycistronique sont réalisés, qui sont ensuite séparés par plus de trans-épissage et la traduction dirigeant séparément ^23. En plaçant un gène codant pour une protéine ou un ARN en épingle à cheveux dans la position en amont de l'opéron et un gène de la protéine fluorescente dans la position en aval, on peut suivre le tissu transgénique sans avoir à étiqueter le gène codant pour la protéine ou de l'ARN en épingle à cheveux. Cette méthode a été utilisée pour exprimer un ARN en épingle à cheveux dans une configuration de l'opéron avec DsRed2 pour atteindre gène knockdown ^14.

Protocol

1 Préparation de l'ADN plasmidique, aiguilles, et plats d'injection Préparer l'ADN de plasmide en utilisant un kit High Speed ​​Maxi ou Midi et concentrer l'ADN à 2,5 mg / ml en utilisant une précipitation à l'éthanol. Le culot d'ADN doit être dissous dans de l'eau désionisée exempte de nucléase. Stocker l'ADN en 10-20 aliquotes pi à -20 ° C. (Voir le tableau supplémentaire 1 pour une liste de vecteurs disponibles) Faire un plat d&#39…

Representative Results

L'établissement de lignes Hydra transgéniques Nourrir les nouveau-nés transgéniques tous les 2-3 jours avec des nauplii d'Artemia. Les nouveau-nés parfois ne mangent pas pendant un jour ou deux après l'éclosion. Certaines larves nouveau-nées seront jamais manger, et ne seront donc pas survivre. Si le nouveau-nés est transgénique soit dans l'ectoderme (figure 1A) ou tissu épithélial endodermique, permettre à l'animal de bourgeon…

Discussion

Hydra reproduit régulièrement de façon asexuée, mais nécessite des stimuli environnementaux pour commencer gamètes producteurs. Ces stimuli ne sont pas bien définis pour la plupart des espèces Hydra et peuvent différer d'une souche à. Un obstacle important à la production de transgéniques Hydra est l'obtention d'embryons sur une base régulière, car il peut être difficile dans un environnement de laboratoire pour induire Hydra pour devenir sexuelle. La souche…

Materials

AEP Hydra Strain	NA	NA	Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petri Dishes	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjection Fish Mold	IBI Scientific	FM-600
Borosilicate Glass with Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Phenol Red	Sigma	P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5	Sigma	F6521
Scalpel Blade #15	Fisher	50-822-421
Mineral oil	Sigma	M8410-500ML
Microinjector	Narishige	IM-9B
Magnetic Stand	Narishige	GJ-1
Iron Plate	Narishige	IP
Joystick Micromanipulator	Narishige	MN-151