Generering av Transgena<em> Hydra</em> Genom Embryo mikroinjektion

Summary

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Abstract

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology¹. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Introduction

Hydra har använts för att studera regeneration, mönsterbildning, och stamceller i cirka 250 år ² Hydra har en enkel kropp plan består av tre cellinjer:. Ektodermal epitel, endodermalt epiteliala och interstitiell. Den rörformiga kroppen är bildad genom den ektodermala och endodermala epiteliala härstamningar, vilka vardera är en enkelcellskikt. Alla av epitelceller i kroppen kolumn är mitotiska. När epitelceller är förskjutna i extremiteterna ^3, huvudet (mun och tentakler) vid den muntliga änden eller foten (basal skiva) vid aboral slutet, de arresterar i G2-fasen av cellcykeln och ändra cell ödet ^4. Cellerna i den interstitiella härstamning uppe inom mellanrummen mellan epitelceller. Denna härstamning stöds av multipotenta stamceller som finns i det ektodermala epitelskikt av kroppen kolumn ^5. De interstitiella stamceller ger upphov till tre somatiska cell typer (nerver, körtelceller och nematocytes) och könscellerna ^6,7.

Som en medlem av stammen Cnidaria, systergrupp till alla bilaterians kan Hydra belysa grundläggande biologiska processer delas av flercelliga djur. Tills nyligen var dessa insatser hindras av bristen på tillförlitliga metoder för störning av geners funktion. Men med utvecklingen av transgena metodik ^1, kan vi nu att dra full nytta av Hydra för att få en bättre förståelse av de grundläggande mekanismer som är gemensamma för flercelliga djur, som till exempel stamcellsfunktion, regeneration, och mönstring. Transgen Hydra linjer etableras genom injektion av plasmid-DNA i embryon, som resulterar i slumpmässig integration och chimär expression i en betydande frekvens av ungarna. En linje med enhetligt uttryck i en viss härstamning kan fastställas genom asexuell förökning. Förmågan att klonalt fortplanta transgENIC Hydra linjer är en fördel över de flesta djurmodeller, som kan förökas endast genom sexuell reproduktion. Dessutom kan transgena celler spåras lätt in vivo på grund av öppenheten i djuret och avsaknaden av endogena fluorescerande proteiner ^8.

Under de sju år som gått sedan de första transgena Hydra linjer gjordes ^1, sådana linjer har använts för en mängd olika tillämpningar. Uttryck av fluorescerande proteiner i olika celltyper har gjort det möjligt att spåra cellrörelse, observera förändringar i cellform, och spåra cell öden både vildtyp villkor och efter kemisk störning ^1,5,9-12. Dessutom uttryck av olika fluorescerande proteiner i de olika utvecklingslinjer möjliggör FACS isolering av specifika cellpopulationer. Denna teknik har använts för sekvensering av stamcells specifika mRNA och linjespecifika små RNA ^13,14. Medan promotorn fören av de två Hydra aktin gener har mest använda, några celltypsspecifik promotorer har identifierats och används för att driva uttryck av GFP i transgena Hydra ^9,11,15,16. I framtiden kommer celltypsspecifik promotorer möjliggöra observation och insamling av specifika celltyp. Dessutom gjordes en transgen tillvägagångssätt framgångsrikt använts för att definiera de cis-verkande regulatoriska elementen i Wnt3 promotorn ^17.

Utvecklingen av transgena metoder i Hydra ger en robust metod för att testa funktionen hos gener som ektopisk uttryck, överuttryck och knockdown. Transgena djur har gjorts att uttrycka fluorescerande-märkta proteiner för att undersöka både funktion och cellulär lokalisering ^18-20. Dessutom expressionen av RNA hårnålar i 3'UTR av en GFP-transgen leder till knockdown av målgener ^21,22. I dessa metoder krävs GFP att identifieraoch spåra transgena vävnaden under skapandet av den transgena linjen. Det är emellertid troligt att GFP-molekyl i en del fall skulle störa funktionen av det märkta proteinet. En nyligen genomförd studie visar att Hydra gener kan arrangeras i ett operon konfiguration, dvs är polycistrona transkript, vilka därefter separeras genom trans splitsad ledare tillsats och translateras separat ^23. Genom att placera en gen som kodar för ett protein eller en RNA-hårnål i positionen uppströms av ett operon och ett fluorescerande proteingenen i nedströms läge kan en spåra transgen vävnad utan att behöva märka den gen som kodar för proteinet eller RNA-hårnål. Denna metod har använts för att uttrycka en RNA hårnål i en konfiguration operon med DsRed2 för att uppnå gen knockdown ^14.

Protocol

1. Framställning av plasmid-DNA, nålar, och Injection svDishes Förbered plasmid-DNA med användning av en höghastighets Maxi eller Midi-kit och koncentrera DNA till 2,5 mg / ml med användning av etanol-utfällning. DNA-pelleten löses upp i nukleasfritt avjoniserat vatten. Förvara DNA i 10 till 20 | il alikvoter vid -20 ° C. (Se Kompletterande tabell 1 för en lista över tillgängliga vektorer) Gör en injektion maträtt med hjälp av agaros att bygga ett tråg för att hål…

Representative Results

Etablering transgena Hydra linjer Feed transgena ungar var 2-3 dagar med Artemia nauplii. Hatchlings ibland inte äter för en dag eller två efter kläckning. Några nya ungar kommer aldrig att äta, och därför kommer inte att överleva. Om hatchling är transgena i antingen ektodermala (Figur 1A) eller endodermalt epitelvävnad, att djuret knoppas och samla knopparna som har den mest transgena vävnaden (Figur 1B, C). Fortsätt att göra d…

Discussion

Hydra återger rutin asexuellt, men kräver miljö stimuli för att börja producera könsceller. Dessa stimuli inte väldefinierad för de flesta Hydra arter och kan variera från stam till stam. En betydande hinder för produktion av transgena Hydra är att få embryon regelbundet eftersom det kan vara svårt att i laboratoriemiljö för att förmå Hydra för att bli sexuellt. Den AEP-stam ^25, emellertid, producerar gameter lätt i laboratoriet, och detta är den enda st…

Materials

AEP Hydra Strain	NA	NA	Email: Celina Juliano at celina.juliano@yale.edu or Hiroshi Shimizu bubuchin2006@yahoo.co.jp
High Speed Maxi Kit	Qiagen	12662
100 x 15 mm Petri Dishes	BD Falcon	351029
75 x 50 mm Glass Microscope Slide	Sigma	CLS294775X50
Microinjection Fish Mold	IBI Scientific	FM-600
Borosilicate Glass with Filament	Sutter Instrument	BF100-50-10	O.D.: 1.0 mm, I.D.: 0.50 mm, 10 cm length
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instrument	P-97
Phenol Red	Sigma	P3532
Jewelers Forceps, Durmont #5	Sigma	F6521
Scalpel Blade #15	Fisher	50-822-421
Mineral oil	Sigma	M8410-500ML
Microinjector	Narishige	IM-9B
Magnetic Stand	Narishige	GJ-1
Iron Plate	Narishige	IP
Joystick Micromanipulator	Narishige	MN-151