ניצול לשכות Galvanotaxis המעוצב מותאמות אישית לחקר כיוונית נדידה של תאי ערמונית

Summary

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

Abstract

השדה החשמלי הפיזיולוגי משרת פונקציות ביולוגיות ספציפיות, כגון בימוי נדידת תאים בפיתוח עובר, תולדה עצבית וריפוי פצע אפיתל. הפעלת שדה חשמלי של זרם ישיר לתאים בתרבית במבחנה גורמת הגירה כיוונית תא, או galvanotaxis. שיטת galvanotaxis 2-ממדית אנחנו מדגימים כאן היא שונה עם פולי מחוייט (ויניל כלוריד) (PVC) תאים, משטח זכוכית, אלקטרודות פלטינה והשימוש בבמה ממונעת שבו התאים הם צילמו. תאי PVC ואלקטרודות פלטינה להציג cytotoxicity נמוך והם סבירים ומחדש שמישים. משטח הזכוכית והבמה מיקרוסקופ הממונעת לשפר את האיכות של תמונות ומאפשרים שינויים אפשריים למשטח הזכוכית וטיפולים לתאים. אנחנו צילמנו את galvanotaxis של שני קווים שאינם סרטניים-הונצח SV40 ערמונית תא, pRNS-1-1 וPNT2. שתי שורות תאים אלה מראות מהירויות הגירה דומות ושניהם נודדים לעברהקתודה, אבל הם עושים להראות במידה שונה של יווניות בgalvanotaxis. התוצאות שהתקבלו באמצעות פרוטוקול זה מצביעים על כך שpRNS-1-1 ושורות תאי PNT2 עשוי להיות מאפיינים מהותיים שונים המסדירים תגובות הנדידה כיוונית שלהם.

Introduction

שדות חשמליים אנדוגני מתגלים ברקמות שונות, כגון עור ^{1, 32, 33} ומוח ^2. השדה החשמלי הפיזיולוגי משרת פונקציות ביולוגיות ספציפיות, כוללים פיתוח בימוי עובר ^{3, 4,} המנחה את תולדה של תהליכים עצביים ^{5, 6} וקידום סגירת אפיתל קרני ופצע ^{1, 7.} במבחנה, יישום של שדה חשמלי נוכחי ישיר לתאים בתרבית מחקה את השדה החשמלי הפיזיולוגי וגורם הגירה כיוונית תא, או galvanotaxis. Galvanotaxis נחקר בfibroblasts ^8, קרטינוציטים דגים ^9, אפיתל אדם וקרטינוציטים קרנית ^10-12, לימפוציטים מסוג ^13, neuroblasts ^2, ובתאים עצביים ^14. כאשר נחשפו לשדה המופעל, רוב התאים למדו להעביר directionally כלפי cathodal (-) הקוטב. ובכל זאת, כמה תאי סרטן, כוללים מאוד גרורתיתאי סרטן השד אנושיים ושורת תאי סרטן הערמונית האנושית PC-3M, לעבור לanodal (+) קוטב ^{15, 16.} מספר מנגנונים מוצעים לתווך galvanotaxis או להסביר את היכולת של התאים לחוש את השדה החשמלי, כולל הפעלה של EGF קולטני ^12, ערוץ נתרן אפיתל ^17, PI3K וPTEN ^18, ושחרורו של סידן יונים ^{15, 19.} המנגנון הוא עדיין לא הבין באופן מלא וזה אפשרי, כי מסלולי איתות מרובים מעורבים בgalvanotaxis.

שיטת galvanotaxis 2-ממדית אנחנו מדגימים כאן היא שימושית כדי לאפיין את ההגירה כיוונית של חסיד, תאי ניעתי, או כדי לפקח על הגירת תאים בודדת ^{10, 12, 17} או הגירה של גיליון של תאים ומחוברות ^{18, 20.} טכניקה זו שונה מ פנג והיפה ^21, וNishimura et al. ¹⁰ עם, תאי PVC ברורים מחוייט, עם coversl הנשלףשב"ס מאפשר לאחזור תא קל לאחר galvanotaxis לניתוח משני, כגון הדמיה חיסונית הקרינה. משטח הזכוכית של תאי galvanotaxis הוא אופטי תואם, המאפשר לצלם בהגדלה גבוהה ועם תאי fluorescently שכותרתו. זה גם מאפשר עיצוב ניסיוני עם שינוי של משטח הזכוכית, כגון שינוי ציפוי פני השטח או חיובים. מפרידי עשויים מס '1 coverglass משמשים בתאי כדי למזער את הזרימה הנוכחית על התאים; לכן חימום ג'אול, שהוא פרופורציונאלי לריבוע של הזרימה הנוכחית, לא לחמם יותר מדי את התאים במהלך הניסוי. הגשרים אגר החיבור למנוע מגע ישיר של אלקטרודות עם התאים ולמנוע שינוי של pH הבינוני או ריכוז יון בgalvanotaxis.

שתי שורות תאי ערמונית אנושית שאינם סרטניות נבדקו לתגובת galvanotaxis במחקר זה. PRNS-1-1 ²² וPNT2 ²³ שניהם SV40-הונצחו, שורות תאי גורם תלוי צמיחה המבטאות את סמני אפיתל cytokeratin 5, 8, 18 ו -19 עם ביטוי נמוך או לא של אנטיגן הספציפי לערמונית (PSA). שני שורות התאים לשמור על מורפולוגיה המצולעים של תאי האפיתל נורמלים, אבל הנורמליות של כרומוזום נצפתה בkaryotyping ^{22, 24.} למרות שpRNS-1-1 וPNT2 לשתף התנהגויות דומות ברוב הניסויים, הם עושים להראות הבדלים במבנה של מבנה acinar וב galvanotaxis. על מטריצת 3-D, Matrigel, pRNS-1-1 תאים ליצור מבני acinar חלולים עם לומן הדומה לרקמת בלוטת הערמונית הרגילה ^25. עם זאת, תאי PNT2 יוצרים spheroids המוצק ללא לומן או אפיתל המקוטב ^26. תאי pRNS-1-1 גם להפגין תגובת galvanotactic גבוהה מPNT2 במחקר הנוכחי. המתאם בין ההיווצרות של מבנה acinar וgalvanotaxis בpRNS-1-1 מצביע על כך שאותות galvanotactic עשויים לשחק תפקיד בארגון יחסי הציבורתנועות ostate בלוטת רקמה בתגובה לשדות חשמליים אנדוגני, ומספקת מאפיינים נוספים להפלות בין 2 שורות תאים אלה.

Protocol

1. תאי culturing ערמונית תרבות pRNS-1-1 וערמונית PNT2 תאים על 100 מנות תרבות מ"מ במדיום RPMI 1640 בתוספת 10% FBS ואנטיביוטיקת antimycotic על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2. רענן מדיום התרבות בכל יום עד שהתאים מגיעים 80% confluency לניסויי galvanotaxis. </o…

Representative Results

שתי שורות של תאי ערמונית (pRNS-1-1 וPNT2) נחקרו בשיטה זו. תאים בשני הקווים להעביר במהירויות דומות של 1.0 +/- 0.3 מיקרון / min במהלך 2 שעות (איור 5 א). עם זאת, כיווניות לשדה החשמלי היא 0.7 +/- 0.3 לpRNS-1-1 הקו, ו -0.2 +/- 0.8 לקו PNT2 (איור 5). התוצאות מראות הבדל משמעותי בgalvanotaxis של שתי ש…

Discussion

הניתוח של תגובת galvanotaxis של תא היה חיווי פונקציונלי חשוב עבור רבים נודדים או צמיחה סלולריות מעבד ^{27, 28.} כאן אנו משתמשים קאמריים מחוייט עם משטח זכוכית לצלם את שתי שורות תאי ערמונית. שורות תאים אלה הפגינו דרגות שונות של galvanotaxis, ואנחנו משערים כי הלוקליזציה תאית או ההפ?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Cells
pRNS-1-1 prostate cells			Lee et. al., (1994)
PNT2 prostate cells	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon et al., (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	warm up to 37°C before use
Fetal Bovine Serum – Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% in PBS, warm up to 37°C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Life Technologies	15240	add 5mL to 500mL medium
2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	–	–	137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056	warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers	Precision Plastics Inc, CA		custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers
Galvanotaxis electrodes	UCD electric shop		platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box	Substrate Engineering, CA		custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5	Fisher	12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1	ThermoScientific	3307
Diamond point marker	ThermoScientific	750
Marine grade silicon sealer, clear	3M	051135-08019
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
6mL syringe	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5mL	Nichiryo	SG-M
Cotton applicators	Purtian Medical Products	806-WC
Qtips	Johnson & Johnson	729389
Nalgene 180 PVC tubing	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2% agar solution
Razor Blade	Personna	74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810R	operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4	Nexcelom	Auto T4
Cellometer counting chambers	Nexcelom	CHT4-SD100-002	load 20uL cell solutions to count
Culture Temp Warming plate	Bel-Art Scienceware	370150000	to keep the galvanotaxis chambers at 37°C
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len	Nikon
Retiga EX CCD camera	Qimaging		Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2	Airgas		special order
Volocity 6.3	PerkinElmer		Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac	Microsoft