Используя специально разработанный гальванотаксис палаты по изучению направленной миграции из клеток простаты

Summary

We present a method to apply a physiological electric field to migrating, immortalized prostate cells in a custom-made galvanotaxis chamber. Using this method, we demonstrate that 2 lines of non-tumorigenic prostate cells demonstrate different degrees of migration directionality in the field.

Abstract

Физиологический электрическое поле служит специфические биологические функции, такие как направление миграции клеток в развитие эмбриона, нейронов и эпителиальных нарост заживления ран. Применение постоянного тока электрическое поле культивируемых клеток в пробирке индуцирует направленную миграцию клеток, или гальванотаксис. 2-мерный метод гальванотаксис демонстрируется здесь модифицированный заказ поли (винилхлорида) (PVC) камер, поверхность стекла, платиновыми электродами и использования моторизованной стадии, на которой клетки изображаемого. Камеры ПВХ и платиновые электроды обладают низкой цитотоксичности и являются доступными и повторного использования. Поверхность стекла и моторизованный столик микроскопа улучшить качество изображения и позволяют возможные изменения в поверхности стекла и лечения к клеткам. Мы снимали гальванотаксис из двух не онкогенных, SV40-увековечена клеточных линий простаты, PRNS-1-1 и PNT2. Эти два клеточных линий показывает, подобные скорости миграции и, как мигрировать в направлениикатод, но они показывают различную степень направленности в гальванотаксис. Полученные результаты с помощью этого протокола предполагают, что PRNS-1-1 и клеточные линии PNT2 могут иметь различные присущие особенности, которые регулируют их направляющие мигрирующих ответов.

Introduction

Эндогенные электрические поля обнаружены в различных тканях, таких как кожа ^{1, 32, 33} и головного мозга ^2. Физиологический электрическое поле служит специфические биологические функции, в том числе направляющего развития эмбриона ^{3, 4,} направляя разрастание нервных процессов ^{5, 6} и продвижение эпителиальных и закрытие раны роговицы ^{1, 7.} В пробирке, применение постоянного тока электрического поля в культивируемых клетках имитирует физиологическую электрического поля и вызывает направленную миграцию клеток, или гальванотаксис. Гальванотаксис была изучена в фибробластах ^8, рыбные кератиноцитов ^9, человеческого эпителия и роговицы кератиноцитов ^10-12, лимфоциты ^13, нейробласты ^2, и нервных клеток-предшественников ^14. При воздействии приложенного поля, большинство исследованных клеток мигрировать направленно к катодной (-) полюса. Тем не менее, несколько раковых клеток, в том числе высокой метастатическойчеловека клетки рака молочной железы и простаты человека линии раковых клеток РС-3М, перейти к анодной (+) полюса ^{15, 16.} Некоторые механизмы, как предложено в качестве посредника гальванотаксис или объяснить способность клеток ощущать электрическое поле, в том числе активации рецепторов эпидермального фактора роста ^12, эпителиальных натриевых каналов ^17, PI3K и PTEN ^18, и выпуск ионов кальция ^{15, 19.} Механизм еще не полностью изучены, и вполне возможно, что несколько сигнальных путей участвуют в гальванотаксис.

2-мерный метод гальванотаксис демонстрируется здесь полезно характеризовать направленную миграцию адгезивных, подвижных клеток, либо контролировать отдельные миграцию клеток ^{10, 12, 17} или миграцию листе сливающихся клеток ^{18, 20.} Этот метод модифицированной из Пэн и Джаффе ^21, а Нисимура и др. ¹⁰ с на заказ, четких камер ПВХ, со съемным coverslIPS позволяет легко поиска клеток после гальванотаксис для вторичного анализа, такие как томография иммуно-флуоресценции. Стекло поверхность гальванотаксис камер оптико-совместимый, которая позволяет съемку на высоких увеличениях и с флуоресцентно-меченых клеток. Это также позволяет экспериментальную конструкцию с модификацией поверхности стекла, например, изменение поверхностного покрытия или сборы. Распорки из № 1 покровного стекла используются в камерах, чтобы минимизировать ток через клеток; Поэтому джоулева тепла, которое пропорционально квадрату тока, не перегреть клетки в ходе эксперимента. Соединительные агар мосты предотвратить непосредственный контакт электродов с клетками и предотвратить изменение рН среды или концентрации ионов при гальванотаксис.

Два не-онкогенные линии предстательной железы человека клеток были исследованы на их ответ гальванотаксис в данном исследовании. В PRNS-1-1 ²² и PNT2 ²³ оба SV40-иммортализованные, фактор роста-зависимой линии клеток, экспрессирующих эпителиальные маркеры Цитокератин 5, 8, 18 и 19 с низким или вообще без экспрессии простатического специфического антигена (ПСА). Обе клеточные линии поддерживают многоугольную морфологию нормальных эпителиальных клеток, но хромосомных аномалий наблюдался в кариотипированием ^{22, 24.} Несмотря на то, PRNS-1-1 и PNT2 схожие поведения в большинстве экспериментов, они показывают различия в формировании структуры ацинозной и в гальванотаксис. На 3-D матрицы, Matrigel, что PRNS-1-1 клетки образуют полые ацинарные структуры с просветами, напоминающих нормально предстательной железы ткани ^25. Тем не менее, PNT2 клетки образуют твердые сфероидов без просвета или поляризованного эпителия ^26. В PRNS-1-1 клетки также демонстрируют более высокую galvanotactic ответ, чем PNT2 в данном исследовании. Корреляция между образованием структуры ацинозной и гальванотаксис в PRNS-1-1 предположить, что galvanotactic сигналы могут играть определенную роль в организации PRostate железы движения ткани в ответ на эндогенные электрических полей, а также предоставляет дополнительные характеристики для различения этих 2 клеточных линий.

Protocol

1. Культивирование клеток простаты Культура PRNS-1-1 и PNT2 клеток простаты на 100 мм чашки для культивирования в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и антибиотиков противогрибкового средства при температуре 37 ° С с 5% СО 2. Обновить питательной среды каждый день до тех пор, пока клетки не ?…

Representative Results

Две линии клеток предстательной железы (PRNS-1-1 и PNT2) были исследованы с помощью этого метода. Клетки обеих линий переноса при подобных скоростью 1,0 +/- 0,3 мкм / мин в течение 2 часов (фиг.5А). Тем не менее, направленность к электрическому полю составляет 0,7 +/- 0,3 для PRNS-1-1 линии, и 0,2 +/- 0,8 д?…

Discussion

Анализ ответ гальванотаксис клетки был важным функциональным показателем для многих клеточных миграционных или ростовых процессов ^{27, 28.} Здесь мы используем заказ камеру со стеклянной поверхностью, чтобы снять два сотовых простаты линий. Эти клеточные линии показали, различные ?…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Cells
pRNS-1-1 prostate cells			Lee et. al., (1994)
PNT2 prostate cells	Sigma-Aldrich	95012613-1VL	Berthon et al., (1995)
Medium and solutions
RPMI 1640 medium	Invitrogen	11875-093	warm up to 37°C before use
Fetal Bovine Serum – Premium	Atlanta Biologicals	S11150	10% in PBS, warm up to 37°C before use
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Life Technologies	15240	add 5mL to 500mL medium
2-propanol	VWR	BDH1133-5GL
PBS	–	–	137mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4 and 1.5mM KH2PO4 in 1000mL of H2O, pH to 7.4 and autoclaved, warm up to 37°C before use
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056	warm up to 37°C before use, treat cells for 3-5 min at 37°C
Galvanotaxis device
Galvanotaxis chambers	Precision Plastics Inc, CA		custom-designed (1/4" X 2" X 3.5"), non-toxic, clear PVC chambers
Galvanotaxis electrodes	UCD electric shop		platinum coiled electrodes with flexable cords
Galvanotaxis power box	Substrate Engineering, CA		custom-designed DC power output with voltmeter
Microscope Cover Glass, Large, 45X50mm-No. 1.5	Fisher	12-544-F
Microscope Cover Glass, small, 25X25mm, No. 1	ThermoScientific	3307
Diamond point marker	ThermoScientific	750
Marine grade silicon sealer, clear	3M	051135-08019
High vacuum grease	Dow Corning	2021846-0807
6mL syringe	Fisher Scientific	05-561-64
Nichiryo Syringe, 1.5mL	Nichiryo	SG-M
Cotton applicators	Purtian Medical Products	806-WC
Qtips	Johnson & Johnson	729389
Nalgene 180 PVC tubing	Nalgene	8000-9030	503/16 ID x 5/16 OD x 1/16 Wall
Bacto-Agar	Difco	0140-01	make 2% agar solution
Razor Blade	Personna	74-0001
Equipments and Software
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810R	operated with an A-4-62 rotor
Cellometer Auto T4	Nexcelom	Auto T4
Cellometer counting chambers	Nexcelom	CHT4-SD100-002	load 20uL cell solutions to count
Culture Temp Warming plate	Bel-Art Scienceware	370150000	to keep the galvanotaxis chambers at 37°C
Eclipse TE-2000 microscope with motorized stage and environmental chamber	Nikon
Plan Fluor 10X/0.30 objective len	Nikon
Retiga EX CCD camera	Qimaging		Cooled CCD camara, mono-color, 12-bit
Compressed air with 5% CO2	Airgas		special order
Volocity 6.3	PerkinElmer		Image acquiring software
Improvision OpenLab 5.5.2	PerkinElmer		Cell tracking software and customized to measure migration angles
FileMaker Pro Advanced, 8.0	FileMaker
Microsoft Excel 2008 for Mac	Microsoft