Induktion der Protein Deletion Durch<em> In Utero</em> Elektroporation, um Defizite in Neuronale Migration in Transgenic Models definieren
Summary
Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.
Abstract
Genetische Löschen mit Hilfe des Cre-Lox-System in transgenen Mauslinien ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Proteinfunktion zu untersuchen. Außer in sehr spezifische Cre-Modelle, Deletion eines Proteins während eines Gewebe- oder Zellpopulation führt häufig zu komplexen Phänotypen aus mehreren zusammenwirkenden Mechanismen resultieren. Bestimmen, ob ein Phänotyp Ergebnisse Störung einer Zelle autonom Mechanismus, der untrennbar mit der betreffenden Zelle, oder von einem nicht-zellautonomen Mechanismus ein, wodurch Beeinträchtigung der Umgebung dieser Zelle führen würde, kann schwer zu erkennen sein. Um einen Einblick in die Proteinfunktion in einem in vivo-Kontext zu ermöglichen, in utero Elektroporation (IUE) ermöglicht Gendeletion in einer kleinen Untergruppe von Zellen innerhalb des Entwicklungsrinde oder einem anderen ausgewählten Hirnregion. IUE können bestimmte Gehirnbereiche, einschließlich der dorsalen Telencephalon, Endhirn medialen, Hippocampus oder Ganglienhügel zielen werden. Dies erleichtert die Beobachtung of die Folgen der Zelle autonom Gendeletion im Rahmen einer gesunden Umwelt. Das Ziel des Protokolls ist es, zu zeigen, wie IUE können zur Unterscheidung zwischen den Zell autonom und nicht zell autonome Wirkungen von Protein Löschung verwendet werden, um einen Defekt in radiale Migration in einer floxed transgene Mauslinie zu analysieren, mit einem Schwerpunkt. Durch den Vergleich des Phänotyps, die aus Gen-Deletion innerhalb des gesamten Kortex im Vergleich IUE-vermittelte Gen-Deletion in einem begrenzten Zellpopulation, einen besseren Einblick in die Proteinfunktion in der Entwicklung des Gehirns kann als mit beiden Techniken in Isolation erreicht werden.
Introduction
Radial Migration ist ein zentraler Prozess zur frühen kortikalen Entwicklung. Es hängt von einer Vielzahl von Zell autonomen Faktoren wie korrekte mitotischen Ausfahrt und die neuronale Differenzierung, Zellpolarität, die Regulierung des Zytoskeletts und die Expression des Transmembran-Rezeptoren, wie auch nicht-zell autonomen Faktoren, wie die Bildung von radialen Gliazellen Gerüst und Sekretion der Migrationsberatung Moleküle 1-3. Da Störungen einer dieser Mechanismen neuronaler Migration in einem transgenen Mausmodell 4-8 In utero Elektroporation (IUE) beeinträchtigt, die Bestimmung der Ursache eines Fehlers in der Migration kann ein komplexer und schwieriger Prozess sein. Kann verwendet werden, zu ergänzen und zu vereinfachen Interpretation des Phänotyps einer genetischen Knock-out-Modells und damit wichtige Mechanismen aufzuklären radiale Migration 7,9-11 erforderlich.
In utero Elektroporation (IUE) ist der Vorgang, bei dem ein Plasmid carryi ng sowohl ein Gen von Interesse und ein Reportergen in die Ventrikel des Gehirns eines Maus oder Rattenembryo injiziert und dann in die Zellen der Herzkammer durch Anwendung eines elektrischen Stroms 12-14 gezogen. Dies ermöglicht dem Prüfer, die Wirkung der nach oben oder unten Regulation eines Gens von Interesse in der Entwicklung oder Funktion elektroporiert Neuronen zu analysieren. Nach IUE können Gehirne für die Immunhistochemie 7,9-11, Elektrophysiologie 15 oder Zellkultur 16,17 verarbeitet werden. Der große Vorteil ist, dass IUE wird ermöglicht hochspezifische Manipulation der Genexpression. Weiterhin kann IUE verwendet, um einen bestimmten Bereich des sich entwickelnden Gehirns durch einen gerichteten Strom (Abbildung 2) zu zielen. IUE können auch verwendet werden, um einen spezifischen Zelltyp, durch Injektion von Plasmiden, die Gene unter der Kontrolle von verschiedenen Promotoren oder Plasmid Aktivierungssysteme abzuzielen (Tetracyclin induzierte Genexpression ist ein Beispiel) 10,18-21.
jove_content "> IUE kann in Verbindung mit dem Cre-Lox-vermittelten Gen Exzision System 7-9,11,22 verwendet werden. kann ein Plasmid, das ein Gen, das die Nachricht für die Cre-Protein kodiert, in einen Embryo homozygot für das Allel floxed (elektroporiert werden in denen das Gen oder spezifische DNA-Regionen werden durch zwei loxP-Stellen für Cre-vermittelte DNA-Rekombination) flankiert. Cre dann induzieren Rekombination des Gens von Interesse spezifisch in elektroporiert neuralen Vorläuferzellen, Erzeugen eines Knock-out des floxed allele.The Wirkung Protein auf neuronale Migration und Entwicklung in einzelnen Neuronen Knockdown kann dann untersucht werden. Die Elektroporation von Cre Rekombination induziert in nur einer kleinen Population von betroffenen Zellen, so dass die Unterstützung von Umwelt intakt. Im Gegensatz dazu gewebespezifische Expression von Cre unter der Kontrolle eines zelltypspezifischen Promotor, tritt während des gesamten Gewebes, so daß beide Migration Neuroblasten und der Umgebung beeinträchtigt werden. So juxtaposition dieser beiden Ansätze können bestimmen, ob ein bestimmter Migrationsdefekt aufgrund autonomer oder Zell nicht autonomen Mechanismen der Zelle ist. Defekte Migration in beiden experimentellen Systemen legt nahe, dass die beobachteten Phänotyp resultiert aus einer Zelle autonom Mechanismus; normaler Migrations nach Elektroporation von Cre mit defekten Migration auf eine gewebespezifische Cre Modell zeigt, dass das Gen von Interesse durch eine nicht-zell autonomen Mechanismus wirkt.IUE kann auch verwendet werden, um Rettungsversuche durch Elektroporation potenzielle Interaktion von Genen in Knock-out-Tiere 7,9,10 durchzuführen. Zum Beispiel könnte ein Forscher versucht, eine Migration Phänotyp in einer transgenen Modells durch Elektroporation ein stromabwärtiges Ziel und Bestimmen, ob die Migration Defekt in elektroporierten Neuronen korrigiert retten. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, dass ein erfolgreicher Rettungs zeigt an, daß normale Migration kann durch Manipulieren der Proteinexpression in einer spe wiederhergestelltsche Neuron, obwohl die Umgebung noch defizient Zielgens. Wiederum ist dieser Ansatz mehr Zeit und kostengünstiger als die Kreuzung oder transgene Linien, mit dem zusätzlichen Vorteil der Bestimmung, ob der defekte Mechanismus Zelle autonom.
IUE verwendet werden, um die Migration zu verfolgen Neuronen durch Elektroporation von einem Reporter-Plasmid in Knock-out-Embryonen (4C) werden. Da nur die Neuronen Auskleidung der Herzkammer zu der Zeit der Operation werden elektroporiert 17 kann IUE verwendet, um die Nervenzellen zu einem bestimmten Zeitpunkt mit dem Vorteil der Visualisierung ihrer Morphologie in vivo geboren folgt.
Schließlich ist es möglich, IUE wie der medialen oder dorsalen Telencephalon, Hippocampus oder Ganglienhügel (Abbildung 2) zu verwenden, um Hirnregionen gezielt. Dies gibt Forschern die Möglichkeit Genfunktion in einem bestimmten Bereich unabhängig von Komplikationen zu untersuchendie sich aus Protein in benachbarten Strukturen Knockdown.
Retinoblastom Protein (pRb), p107 und p130 umfassen die Tasche Proteinfamilie und sind gut etabliert Regulatoren des Zellzyklus zu beenden. Allerdings gibt es immer mehr Anzeichen dafür, dass diese Proteine des Zellzyklus unabhängige Aspekte der neuralen Entwicklung regulieren auch. Wie wir bereits gezeigt haben, pRb und p107 spielen eine entscheidende Rolle in beiden tangentialen 4,23 und radiale Migration 6. Hier zeigen wir die Rolle der Tasche Proteinfamilienmitglieder pRb und p107 neuronaler Migration 6, den Einsatz von in utero Elektroporation von Cre in einem transgenen Modell veranschaulichen. Zusammengefasst stellt IUE eine leistungsfähige Möglichkeit zum Analysieren Zelle autonom Wirkungen der Gen-Deletion (oder Überexpression). Wenn mit gewebespezifischen Knock-out-Modelle kombiniert werden, können IUE zusätzliche Informationen über die Mechanismen, die neuronale Migration bieten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zwei der wichtigsten Herausforderungen bei der Durchführung in utero Elektroporationen sind 1) verhindert Embryoletalität und 2) abnehmende Variabilität zwischen Elektroporationen. Einer der wichtigsten Faktoren bei der Vermeidung Letalität ist Nadelqualität, da stumpfe Nadeln verursachen mehr Schaden an dem Embryo. Beim Schneiden der Nadel, halten Sie die Spitze so lange wie möglich während immer noch eine sichtbare Tröpfchen von 0,1-0,2 & mgr; l der Flüssigkeit zu erscheinen im Anschluss an eine …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to Pierre Mattar and Freda Miller for their assistance with the in utero electroporation and to Noel Ghanem and Bensun Fong for creating diagrams. We thank Linda Jui and Jason G. MacLaurin for excellent technical assistance. Equipment was supported by the Centre for Stroke Recovery.
This work was supported by a scholarship from HSFO and OGS to D.S.S. and a CIHR grant to R.S.S.
Materials
| Table 1: Equipment and Materials | ||||
| Product Name | Company | Catalog Number | Description | |
| ECM 830 Square Wave Electroporator | BTX Harvard Apparatus | 45-0052 | Electroporator only – buy cables separately (45-0204) | |
| 1250FS Footswitch for ECM 830 | BTX Harvard Apparatus | 45-0211 | Foot paddle is necessary for hands-free electroporation | |
| Tweezertrodes | BTX Harvard Apparatus | 45-0489 (5mm) 45-0488 (7mm) | Platinum forcep style electrodes | |
| Femtojet | Eppendorf | 920010504 | Microinjector | |
| Griphead 0 | Eppendorf | 920007414 | Holds the pulled needle | |
| Universal Capillary Holder | Eppendorf | 920007392 | Connects griphead to tube | |
| Injection Tube | Eppendorf | 920007431 | Connects capillary holder to Femtojet | |
| Foot Control | Eppendorf | 920005098 | Foot paddle for hands-free injection | |
| Microloader Tips | Eppendorf | 930001007 | Tips for loading the pulled capillary tubes | |
| Plasmid Mega Kit | Qiagen | 12181 | 5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252-5G | Non-toxic dye | |
| Extra Fine Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14084-08 | For trimming the needles | |
| Bonn Strabismus Scissors | Fine Science Tools | 14084-09 | ||
| Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | Straight | |
| Colibri Retractors | Fine Science Tools | 17000-03 | ||
| Stapler | Fine Science Tools | 12031-07 | For 7mm clips | |
| Castroviejo Needle Holder | Medical Tools | SNH-6737 | Straight, with lock | |
| Needle Puller | Narishige | PC-10 | For pulling microcappillaries | |
| Microcapillaries | Drummond | 1-000-800 | 0.4 mm inner diameter glass capillary tubes | |
References
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