La inducción de la proteína a través de Supresión<em> In Utero</em> La electroporación para definir Déficits en Neuronal migración en modelos transgénicos

Summary

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

Abstract

Supresión genética utilizando el sistema Cre-Lox en líneas de ratones transgénicos es una herramienta poderosa para estudiar la función de la proteína. Sin embargo, excepto en los modelos muy específicos Cre, la supresión de una proteína a lo largo de un tejido o célula de la población a menudo conduce a fenotipos complejos resultantes de múltiples mecanismos que interactúan. La determinación de si un fenotipo resultados de la interrupción de un mecanismo autónomo celular, que es intrínseca a la célula en cuestión, o desde un mecanismo autónomo no celular, que resultaría de deterioro del medio ambiente de esa célula, pueden ser difíciles de discernir. Para obtener una perspectiva de la función de proteínas en un contexto in vivo, in utero electroporación (IUE) permite la supresión de genes en un pequeño subconjunto de células dentro de la corteza en desarrollo o alguna otra región del cerebro seleccionada. IUE se puede utilizar para apuntar a áreas específicas del cerebro, incluyendo el telencéfalo dorsal, telencéfalo medial, el hipocampo, o eminencia ganglionar. Esto facilita la observación of las consecuencias de célula autónoma deleción del gen en el contexto de un entorno saludable. El objetivo de este protocolo es mostrar cómo IUE se puede utilizar para analizar un defecto en la migración radial en una línea de ratones transgénicos floxed, con énfasis en la distinción entre los efectos de células autónomas autónomos y no celulares de eliminación de proteínas. Al comparar el fenotipo resultante de la deleción del gen dentro de toda la corteza en comparación con deleción del gen mediada por IUE en una población celular limitada, una mayor comprensión de la función de proteínas en el desarrollo del cerebro se puede obtener mediante el uso de cualquiera de las técnicas en el aislamiento.

Introduction

Migración radial es un proceso fundamental para el desarrollo cortical temprana. Depende de una variedad de factores autónomos celulares, tales como correcta la salida de mitosis y la diferenciación neuronal, la polaridad celular, regulación de la dinámica y la expresión de receptores transmembrana del citoesqueleto, así como los factores autónomos no celulares, tales como la formación del andamio glial radial y secreción de orientación migratoria moléculas ^1-3. Desde la interrupción de cualquiera de estos mecanismos puede perjudicar la migración neuronal en un modelo de ratón transgénico ^4-8, la determinación de la causa subyacente de un defecto en la migración puede ser un proceso complejo y difícil. En el útero de electroporación (IUE) se puede utilizar para complementar y simplificar interpretación del fenotipo de un modelo genético knock-out y por lo tanto dilucidar los mecanismos importantes que se requieren para la migración radial ^7,9-11.

En electroporación in utero (IUE) es el proceso por el cual un carryi plásmido ng tanto un gen de interés y un reportero se inyecta en el ventrículo en el cerebro de un ratón o rata embrión y luego introduce en las células que recubren el ventrículo a través del uso de una corriente eléctrica ^12-14. Esto permite al investigador analizar el efecto de arriba o hacia abajo regulación de un gen de interés en el desarrollo o la función de las neuronas electroporadas. Después de IUE, cerebros pueden ser procesadas para inmunohistoquímica ^7,9-11, electrofisiología ¹⁵ o cultivo celular ^16,17. La principal ventaja de IUE es que se permite la manipulación altamente específica de la expresión génica. Además, IUE se puede utilizar para apuntar a una región específica del cerebro en desarrollo a través de una corriente (Figura 2) se indica. IUE también se puede utilizar para dirigirse a un tipo celular específico a través de la inyección de plásmidos que llevan genes bajo el control de diferentes promotores o sistemas de activación plásmido (inducida por tetraciclina de la expresión génica es un ejemplo) ^10,18-21.

jove_content "> IUE puede ser utilizado en conjunción con el sistema de escisión de genes mediada por Cre-Lox ^7-9,11,22. Un plásmido que contiene un gen que codifica el mensaje para la proteína Cre puede someterse a electroporación en un embrión homocigotos para el alelo floxed ( en el que las regiones de genes o ADN específica están flanqueadas por dos sitios loxP para Cre recombinación de ADN mediada). Cre entonces inducir la recombinación del gen de interés específicamente en los precursores neuronales electroporadas, generando un knock-out de la floxed allele.The efecto de proteína desmontables sobre la migración y el desarrollo dentro de las neuronas individuales neural puede entonces ser estudiada. La electroporación de Cre induce la recombinación en una pequeña población de células afectadas, dejando el entorno de apoyo intacto. En cambio, la expresión específica de tejido de Cre bajo el control de un tipo celular específico promotor, se produce a lo largo de todo el tejido de modo que ambos neuroblastos migran y el ambiente circundante podrían verse afectados. Por lo tanto, juxtaposition de estos dos enfoques puede determinar si un defecto migración dada es debido a los teléfonos mecanismos no autónomos autónomos o celulares. La migración defectuosa en ambos sistemas experimentales sugiere que los resultados fenotipo observado desde un mecanismo autónomo de la célula; la migración normal después de la electroporación de Cre con la migración defectuosa en un modelo de Cre específica de tejido indica que el gen de interés está actuando a través de un mecanismo autónomo no celular.

IUE también se puede utilizar para llevar a cabo experimentos de rescate por electroporación genes que interactúan potenciales en animales knock out ^7,9,10. Por ejemplo, un investigador podría intentar rescatar a un fenotipo de la migración en un modelo transgénico por electroporación un blanco de abajo y determinar si el defecto se corrige en la migración de las neuronas a electroporación. Esto tiene la ventaja adicional de que un rescate exitoso indica que la migración normal puede ser restaurado mediante la manipulación de la expresión de proteínas en un speneurona especí-, a pesar de que el ambiente circundante todavía es deficiente para el gen diana. Una vez más, este enfoque es más tiempo y rentable que cruzar o la generación de líneas transgénicas, con el beneficio añadido de determinar si el mecanismo defectuoso es la célula autónoma.

IUE se puede utilizar para realizar un seguimiento de la migración de las neuronas a través de electroporación de un plásmido reportero en knock out embriones (Figura 4C). Como sólo las neuronas que recubren el ventrículo en el momento de la cirugía se electroporan ^17, IUE se puede utilizar para seguir las neuronas nacidos en un momento determinado con la ventaja de visualización de su morfología in vivo.

Finalmente, es posible utilizar IUE para apuntar regiones del cerebro tales como el telencéfalo o medial dorsal, hipocampo o eminencia ganglionar (Figura 2). Esto le da a los investigadores la facultad de investigar la función de genes en un área específica independiente de complicaciones de Resultadosción de la proteína desmontables en las estructuras vecinas.

Proteína retinoblastoma (pRb), p107 y p130 comprenden la familia de proteínas bolsillo y se los reguladores de salida del ciclo celular bien establecido. Sin embargo, cada vez hay más pruebas de que estas proteínas también regulan el ciclo celular aspectos independientes del desarrollo neural. Como hemos demostrado anteriormente, pRb y p107 desempeñan un papel crucial tanto tangencial ^4,23 y la migración radial ^6. Aquí, nos demuestran el papel de la proteína bolsillo familiares pRb y p107 en la migración neuronal ⁶ de ejemplificar el uso de electroporación en el útero de la CRE en un modelo transgénico. En resumen, IUE proporciona una poderosa manera de analizar los efectos de células autónomas de supresión de genes (o sobreexpresión). Cuando se combina con específica noquear modelos tejidos, IUE puede proporcionar información adicional con respecto a los mecanismos que controlan la migración neuronal.

Protocol

NOTA: Todos los experimentos fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Cuidado de Animales de Ottawa, la adhesión a las directrices del Consejo Canadiense de los Animales. Preparación 1. Pre-quirúrgico y de los Materiales Preparación de plásmido: Preparar plásmidos utilizando el Qiagen Megaprep de acuerdo con el protocolo del fabricante. Inocular al menos 400 ml de caldo LB con bacterias transformadas para asegurar un alto rendimiento de ADN y s…

Representative Results

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo’s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (…

Discussion

Dos de los principales desafíos en la realización en electroporaciones útero son 1) la prevención de letalidad embrionaria y 2) la disminución de la variabilidad entre electroporaciones. Uno de los factores más importantes en la prevención de la letalidad es la calidad de la aguja, como agujas romas infligen más daño al embrión. Al cortar la aguja, mantener la punta el mayor tiempo posible mientras que todavía permite una gotita visible de 0,1-0,2 l de fluido a aparecer después de una bomba…

Materials

Table 1: Equipment and Materials
Product Name	Company	Catalog Number		Description
ECM 830 Square Wave Electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0052		Electroporator only – buy cables separately (45-0204)
1250FS Footswitch for ECM 830	BTX Harvard Apparatus	45-0211		Foot paddle is necessary for hands-free electroporation
Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0489 (5mm)         45-0488 (7mm)		Platinum forcep style electrodes
Femtojet	Eppendorf	920010504		Microinjector
Griphead 0	Eppendorf	920007414		Holds the pulled needle
Universal Capillary Holder	Eppendorf	920007392		Connects griphead to tube
Injection Tube	Eppendorf	920007431		Connects capillary holder to Femtojet
Foot Control	Eppendorf	920005098		Foot paddle for hands-free injection
Microloader Tips	Eppendorf	930001007		Tips for loading the pulled capillary tubes
Plasmid Mega Kit	Qiagen	12181		5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G		Non-toxic dye
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08		For trimming the needles
Bonn Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14084-09
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11050-10		Straight
Colibri Retractors	Fine Science Tools	17000-03
Stapler	Fine Science Tools	12031-07		For 7mm clips
Castroviejo Needle Holder	Medical Tools	SNH-6737		Straight, with lock
Needle Puller	Narishige	PC-10		For pulling microcappillaries
Microcapillaries	Drummond	1-000-800		0.4 mm inner diameter glass capillary tubes