L'induction de la protéine de suppression Grâce<em> In Utero</em> Électroporation à Définir déficits migration neuronale dans des modèles transgéniques

Summary

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

Abstract

Deletion génétique en utilisant le système Cre-Lox dans des lignées de souris transgéniques est un outil puissant utilisé pour étudier la fonction des protéines. Cependant, à l'exception des modèles Cre très spécifiques, la deletion d'une protéine dans l'ensemble d'une population de tissus ou de cellules conduit souvent à des phénotypes complexes résultant de l'interaction de plusieurs mécanismes. Déterminer si un phénotype résultats de perturbation d'un mécanisme autonome de la cellule, qui est intrinsèque à la cellule en question, ou d'un mécanisme autonome non-cellulaire, qui résulterait de la dépréciation de l'environnement de cette cellule, peuvent être difficiles à discerner. Pour mieux comprendre la fonction des protéines dans un contexte in vivo, in utero électroporation (IUE) permet la suppression de gène dans un petit sous-ensemble de cellules dans le cortex développement ou une autre région du cerveau sélectionné. IUE peut être utilisé pour cibler des zones spécifiques du cerveau, y compris le télencéphale dorsal, télencéphale médial, hippocampe, ou éminence ganglionnaire. Ceci facilite l'observation of les conséquences de cellule autonome deletion des gènes dans le contexte d'un environnement sain. L'objectif de ce protocole est de montrer comment IUE peut être utilisé pour analyser un défaut dans la migration radiale dans une lignée de souris transgéniques floxé, en mettant l'accent sur la distinction entre les effets cellulaires autonomes autonomes et non-cellulaire de la protéine suppression. En comparant le phénotype résultant de la délétion des gènes dans l'ensemble du cortex par rapport à deletion de gène à médiation par IUE dans une population de cellules limité, mieux comprendre la fonction des protéines dans le développement du cerveau peuvent être obtenus qu'en utilisant soit la technique de façon isolée.

Introduction

La migration radiale est un processus au cœur du développement cortical précoce. Il dépend de divers facteurs autonomes portables, tels que sortie correct mitotique et la différenciation neuronale, la polarité cellulaire, régulation de la dynamique du cytosquelette et l'expression de récepteurs transmembranaires, ainsi que des facteurs autonomes non cellulaires, tels que la formation de l'échafaudage gliale radial et la sécrétion d'orientation migratoire molécules ^1-3. Depuis la perturbation de l'un de ces mécanismes peut nuire à la migration neuronale dans un modèle de souris transgénique ^4-8, déterminer la cause sous-jacente d'un défaut dans la migration peut être un processus complexe et difficile. In utero électroporation (IUE) peut être utilisé pour compléter et simplifier interprétation du phénotype d'un modèle knock-out génétique et donc à élucider les mécanismes importants nécessaires pour la migration radiale ^7,9-11.

In utero électroporation (IUE) est le processus par lequel un plasmide carryi ng à la fois un gène d'intérêt et un rapporteur est injectée dans le ventricule du cerveau d'un embryon de souris ou de rat, puis aspiré dans les cellules qui tapissent le ventricule par l'utilisation d'un courant électrique ^14.12. Cela permet à l'enquêteur d'analyser l'effet de haut ou le bas régulation d'un gène d'intérêt dans le développement ou la fonction des neurones électroporation. Après IUE, cerveaux peuvent être traitées pour l'immunohistochimie ^7,9-11, électrophysiologie ¹⁵ ou culture cellulaire ^16,17. L'avantage majeur de l'IUE est qui est permet une manipulation très spécifique de l'expression génique. En outre, IUE peut être utilisé pour cibler une région spécifique du cerveau en développement à travers un courant dirigé (Figure 2). IUE peut également être utilisé pour cibler un type cellulaire particulier par l'injection des plasmides portant des gènes sous le contrôle de différents promoteurs ou des systèmes d'activation de plasmide (tetracycline induit l'expression du gène est un exemple) ^10,18-21.

jove_content "> IUE peut être utilisé en conjonction avec le système d'excision à médiation par le gène Cre-Lox ^7-9,11,22. Un plasmide contenant un gène codant pour la transmission pour la protéine Cre peut être une électroporation dans des embryons homozygotes pour l'allèle floxé ( dans lequel les régions de gènes ou d'ADN spécifique sont flanquées par deux sites loxP pour la Cre médiation par recombinaison de l'ADN). Cre alors induire une recombinaison du gène d'intérêt spécifiquement dans des précurseurs neuraux électroporation, la génération d'un knock-out de la floxée allele.The effet de protéines knockdown sur la migration neuronale et le développement dans les neurones individuels peut alors être étudié. électroporation de Cre induit recombinaison que dans une petite population de cellules touchées, laissant l'environnement soutien intact. En revanche, expression tissulaire spécifique de Cre sous le contrôle d'un type spécifique de cellules promoteur, se produit tout au long de l'ensemble du tissu de sorte que les deux neuroblastes en migration et le milieu environnant pourraient être affectées. Ainsi, juxtaposition de ces deux approches peut déterminer si un défaut de migration donné est due à la cellule mécanismes non autonomes ou autonomes cellulaires. Migration défectueux dans les deux systèmes expérimentaux suggèrent que les résultats de phénotype observé à partir d'un mécanisme autonome de cellules; migration normale après électroporation avec Cre de migration défectueux dans un modèle Cre spécifique des tissus indique que le gène d'intérêt agit par l'intermédiaire d'un mécanisme autonome non-cellulaire.

IUE peut également être utilisé pour effectuer des expériences de sauvetage par électroporation gènes interagissent potentiels en assommer les animaux ^7,9,10. Par exemple, un enquêteur pourrait tenter de sauver un phénotype de migration dans un modèle transgénique par électroporation d'une cible en aval et de déterminer si le défaut de migration est corrigé dans les neurones électroporation. Ceci présente l'avantage supplémentaire que un sauvetage réussi indique que la migration normale peut être restaurée en manipulant l'expression des protéines dans une SPEneurone cifique, bien que le milieu environnant est encore déficiente pour le gène ciblé. Encore une fois, cette approche est plus de temps et plus rentable que de traverser ou de générer des lignées transgéniques, avec l'avantage supplémentaire de déterminer si le mécanisme défectueux est une cellule autonome.

IUE peut être utilisé pour suivre la migration des neurones par électroporation d'un plasmide rapporteur dans assommer embryons (Figure 4C). Comme seuls les neurones qui tapissent le ventricule au moment de la chirurgie sont électroporées ^17, IUE peut être utilisé pour suivre les neurones nées à un moment précis avec l'avantage de la visualisation de la morphologie in vivo.

Enfin, il est possible d'utiliser IUE pour cibler des régions cérébrales telles que le télencéphale dorsal medial ou, de l'hippocampe ou de l'éminence ganglionnaire (figure 2). Cela donne chercheurs le pouvoir d'enquêter fonction du gène dans une zone spécifique indépendant de complications Résultattion de protéine knockdown dans des structures voisines.

protéine du rétinoblastome (PRB), p107 et p130 comprennent la famille des protéines de poche et sont des régulateurs de la sortie du cycle cellulaire bien établie. Cependant, il ya plus de preuves que ces protéines régulent également cycle cellulaire aspects indépendants du développement neuronal. Comme nous l'avons montré précédemment, PRB et p107 jouent un rôle crucial à la fois tangentielle ^4,23 et la migration radiale ^6. Ici, nous démontrons le rôle des protéines de poche membres de la famille pRb et p107 sur la migration neuronale ⁶ pour illustrer l'utilisation de électroporation in utero de Cre dans un modèle transgénique. En résumé, IUE fournit un moyen puissant d'analyse des effets de cellules autonomes de délétion du gène (ou la surexpression). Lorsqu'il est combiné avec tissu spécifique assommer modèles, IUE peut fournir des informations supplémentaires concernant les mécanismes de contrôle de la migration neuronale.

Protocol

NOTE: Toutes les expériences ont été approuvés par l'Université du comité d'éthique le soin des animaux d'Ottawa, en respectant les lignes directrices du Conseil canadien de protection des animaux. Préparation 1. Pré-chirurgical et Matériaux Plasmide Préparation: Préparation des plasmides en utilisant le Qiagen Megaprep selon le protocole du fabricant. Inoculer au moins 400 ml de bouillon LB avec des bactéries transformées pour assurer un rendeme…

Representative Results

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo’s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (…

Discussion

Deux des principaux défis dans l'exécution de électroporations in utero sont 1) la prévention embryocides et 2) en diminuant la variabilité entre électroporations. Un des facteurs les plus importants dans la prévention de létalité est la qualité de l'aiguille, comme aiguilles émoussées infligent plus de dommages à l'embryon. Lors de la coupe de l'aiguille, gardez la pointe le plus longtemps possible tout en permettant une gouttelette visible de 0,1 à 0,2 pi de fluide à ap…

Materials

Table 1: Equipment and Materials
Product Name	Company	Catalog Number		Description
ECM 830 Square Wave Electroporator	BTX Harvard Apparatus	45-0052		Electroporator only – buy cables separately (45-0204)
1250FS Footswitch for ECM 830	BTX Harvard Apparatus	45-0211		Foot paddle is necessary for hands-free electroporation
Tweezertrodes	BTX Harvard Apparatus	45-0489 (5mm)         45-0488 (7mm)		Platinum forcep style electrodes
Femtojet	Eppendorf	920010504		Microinjector
Griphead 0	Eppendorf	920007414		Holds the pulled needle
Universal Capillary Holder	Eppendorf	920007392		Connects griphead to tube
Injection Tube	Eppendorf	920007431		Connects capillary holder to Femtojet
Foot Control	Eppendorf	920005098		Foot paddle for hands-free injection
Microloader Tips	Eppendorf	930001007		Tips for loading the pulled capillary tubes
Plasmid Mega Kit	Qiagen	12181		5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers
Fast Green FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G		Non-toxic dye
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08		For trimming the needles
Bonn Strabismus Scissors	Fine Science Tools	14084-09
Graefe Forceps	Fine Science Tools	11050-10		Straight
Colibri Retractors	Fine Science Tools	17000-03
Stapler	Fine Science Tools	12031-07		For 7mm clips
Castroviejo Needle Holder	Medical Tools	SNH-6737		Straight, with lock
Needle Puller	Narishige	PC-10		For pulling microcappillaries
Microcapillaries	Drummond	1-000-800		0.4 mm inner diameter glass capillary tubes