Abstract
Insektizidresistenz stellt ein großes Problem für die Malariakontrollprogrammen. Mücken Anpassung an eine Vielzahl von Veränderungen in der Umwelt schnell, so dass die Malaria unter Kontrolle eine allgegenwärtige Problem in tropischen Ländern. Die Entstehung von resistenten Populationen Insektizid garantiert die Erforschung von neuartigen Arzneimittelziel Wege und Verbindungen für Vektor-Moskito-Kontrolle. Epigenetische Medikamente werden auch in der Krebsforschung etabliert, aber nicht viel über deren Auswirkungen auf Insekten bekannt. Diese Studie liefert ein einfaches Protokoll für die Prüfung der toxikologischen Wirkungen von 3-Deazaneplanocin A (DZNep), eine experimentelle zugelassene epigenetische Arzneimittel zur Krebstherapie, in der Malaria-Vektor, Anopheles gambiae. Eine konzentrationsabhängigen Anstieg der Sterblichkeit und Abnahme der Größe wurde in unreifen Moskitos zu DZNep ausgesetzt beobachtet, während die Verbindung reduziert die Fruchtbarkeit der erwachsenen Mücken in Bezug auf Behandlungen zu kontrollieren. Darüber hinaus gab es eine drogenabhängige Abnahme der S -Adenosylhomocystein (SAH) Hydrolaseaktivität in Mücken nach Exposition gegenüber DZNep Bezug auf Behandlungen zu kontrollieren. Diese Protokolle stellen die Forscher mit einer einfachen, Schritt-für-Schritt-Verfahren, um mehrere toxikologische Endpunkte für ein experimentelles Medikament zu beurteilen und wiederum zeigen eine einzigartige mehrgliedrige Ansatz für Ausflüge in die toxikologischen Wirkungen von wasserlöslichen epigenetische Arzneimittel oder Verbindungen Interesse gegen vector Mücken und andere Insekten.
Introduction
Malaria ist für die höchste Anzahl von Insekten verursachten Todesfälle in der Welt verantwortlich. Schätzungsweise 219 Millionen Fälle treten jährlich weltweit, was zu etwa 660.000 Todesfällen, vor allem in Afrika ein. Trotz aller gemeinsamen Bemühungen, Malaria Programme mehrere Herausforderungen. Während insektizide behandelten Moskitonetzen und Innenrest Spritzen bilden wichtige Komponenten des Programms, Resistenz gegen Insektizide in der lokalen Bevölkerung behindern diese Bemühungen 2. Die rasche Zunahme der Insektizide resistent Mückenpopulationen weitgehend auf die Fähigkeit der Malariamücken, schnell auf Veränderungen in ihrer Umgebung anpassen und nutzen unterschiedliche Nischen 3,4,5 zugeschrieben. Um die bestehenden Mechanismen der Insektizid-Resistenz zu überwinden, ist die Erforschung von neuartigen Insektizid Ziele und nächste Generation Verbindungen gewährleistet. Eine einfache, Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Bestimmung der Wirksamkeit von experimentellen Insektizide auf die verschiedenen Entwicklungsstadien der Malaria-mosquitoes erheblich verbessern würde diese Bemühungen.
Pharmakologische Untersuchungen der Wirkung von Medikamenten auf Zelllinien und Tiermodellen haben die Verwendung von epigenetischen Medikamenten als ein nützliches Werkzeug zur Modulation der Genetik und Physiologie von Zellen und Organismen hergestellt. DNA-Methylierung und Histon-Modifikation gibt zwei epigenetische Mechanismen, die die Genexpression in vielzelligen Organismen beeinflussen, ohne die zugrunde liegenden DNA-Sequenz 6. Post-translationale Modifikationen wie Methylierung spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Zellintegrität und Genexpression und kann einige grundlegende Prozesse 7,8,9 beeinflussen. Forschung in einigen Insektenarten haben die Bedeutung der Epigenetik in Verfahren, die Oogenese hervorgehoben und Erhaltung von Stammzellen 10 sowie Dosiskompensation 11. Jedoch werden solche Aspekte der Krankheitsvektoren noch erforscht werden. Verwendung einer Verbindung, dieses System in Mücken modulieren, können Sie uns mit in liefernSehenswürdigkeiten in der neuen Insektizid Zielpfade. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) ist eine bekannte Histonmethylierung Inhibitor, der Auswirkungen auf die verschiedenen Arten von Krebs wurden untersucht 12,13,14,15,16. DZNep ist ein stabiles wasserlösliches Arzneimittel, das epigenetische indirekt hemmt Histon Lysin N-methyltransferase (EZH2), eine Komponente der Polycomb repressive Komplex 2 (PRC2) in Säugerzellen. PRC2 spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Wachstums von Stammzellen in multizellulären Organismen und Histon-Methylierung ist ein Schlüsselaspekt der PRC2 vermittelte Gen-Silencing. Bei immungeschwächten Mäusen Zellen mit DZNep vorbehandelt wurde gezeigt, dass weniger tumorerzeugende 17 zu sein. Dieses Medikament wird immer für die Untersuchung anderer Krankheiten, wie zum Beispiel nicht-alkoholische Fettleber, in der EZH2 beteiligt ist 18 verwendet. DZNep ist ein etablierter S -adenosylhomocysteine (SAH) Hydrolaseinhibitors 19, 20. Die Hemmung der SAH-Hydrolase-Ergebnisse in eineAkkumulation von SAH und wiederum führt zur Hemmung der Methyltransferase-Aktivität durch die Begrenzung des verfügbaren methyl Donorgruppen. SAH ein Aminosäurederivat durch Organismen wie Insekten, in ihren Stoffwechselwege verwendet. Eine neue Studie hat gezeigt, dass DZNep in niedrigen Dosen können Diapause beeinflussen und verzögern die Entwicklung von Insekten 21 gezeigt.
Hier wird ein robustes Verfahren, um die Auswirkungen einer wasserlöslichen Verbindung von verschiedenen Lebensstadien von Moskitos zu untersuchen wird entwickelt. Die drei Teile des Protokolls enthalten Anweisungen für die Prüfung der Auswirkungen einer wasserlöslichen Verbindung auf unreifen Moskitos, Erwachsenen Blut-Fütterung Frauen, und die Enzymaktivität der erwachsenen männlichen und weiblichen Mücken. Zuerst wird DZNep in Wasser gelöst, um unreifen Moskitos Entwicklung und das Überleben zu studieren. Dies wird in zwei Konzentrationen durchgeführt, um alle Unterschiede, die sich aus 10-fachen Anstieg der Wirkstoffexposition zu vergleichen. Um die Wirkung des Medikaments auf erwachsene weibliche Mücken, DZNep erkundenauf defibrilliert Schafblut hinzugefügt und das Blut künstlich zu Frauen geleitet. Anschließend wird das Ergebnis des Medikaments auf Fruchtbarkeit sucht. Schließlich wird ein Test der enzymatischen Aktivität unter Verwendung von 5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoesäure) (DTNB) als Indikator, um den Effekt auf DZNep SAH Hydrolase Hemmung in erwachsene männliche und weibliche Mücken bestimmen. Während dieses Protokoll mit einem Malaria-Mücke, Anopheles gambiae entwickelt, kann es leicht zur Untersuchung der Wirkungen von Verbindungen der Zinsen auf Stechmückenarten oder andere Insekten angepasst werden. Die in diesem Protokoll aufgeführten Techniken können nicht effizient auf ein Arzneimittel mit begrenzter oder keiner Löslichkeit in Wasser oder wäßrigen Medien angewendet werden.
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Protocol
Anmerkung: Die drei Teile des Protokolls beschreiben die wässrige Belichtung des DZNep Medikament Larven Mücken, einem blutbasierten Belichtung DZNep an erwachsene Weibchen ihre Wirkung der Fruchtbarkeit zu untersuchen und SAH-Hydrolase-Hemmung durch DZNep gemessen unter Verwendung eines einfachen kolorimetrischen Technik. Eine schematische Darstellung dieser Untersuchungen ist in Abbildung 1 dargestellt.
1. Unreife Mosquito Entwicklung und Hinterbliebenen Assays
HINWEIS: Dieser Abschnitt erklärt die Verwendung eines wasserlöslichen Wirkstoff, der Mückenlarven Entwicklung und das Überleben beeinflusst.
- Hatch A. gambiae Eier bei 28 ° C in destilliertem Wasser (dH 2 O) und Rück sie 2. Larvenstadium.
- Nehmen Sie ein Sechs-Well-DNase, RNase freie Zellkulturplatte und gießen Sie 10 ml dH 2 O in jede Vertiefung.
- Wählen Mückenlarven an 2. Larvenstadium und fügen 15 Larven pro Vertiefung. Vor der Zugabe der 2. Larvenstadium bis zum Teller, S.ut sie auf einem Papiertuch für 2-3 Sekunden, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
- Label-Brunnen mit farbcodierten Bänder Experiment zufällig. Beschriften Sie zwei Vertiefungen pro Testkonzentration auf jeder Platte (Abbildung 2).
- Eine 1 mM DZNep chlorid (MW = 298,73) Stammlösung durch Auflösen von 0,3 mg DZNep in 1 ml dH 2 O. Brühe Lösung DZNep.HCl kennzeichnungs Vertiefungen, um eine Endkonzentration von 0,5 & mgr; M und 5,0 & mgr; M.
HINWEIS: Die Stammlösung kann bei 4 gespeichert werden ° C für kurzfristige (1 Tag bis zu einem Monat) oder -20 ° C für die langfristige (länger als einen Monat).
HINWEIS: Die Zugabe der Stammlösung zum vorgenannten Konzentrationen nicht das Volumen des Wassers in den Vertiefungen erheblich ändern. Jedoch im Falle von viel höheren Konzentrationen ist es ratsam, die Verbindung im Larvenmedium lösen, um eine unnötige Verdünnung der Verbindung zu vermeiden. - In gleicher Höhe Flocke Fischfutter in jede Vertiefung. Die Plattes und inkubieren Sie bei 28 ° C in einem Inkubator.
- Notieren Sie sich die Sterblichkeit für die DZNep-behandelten und unbehandelten Larven Mücken nach einer 24-Stunden-Expositionszeit. Entfernen und entsorgen Sie keine toten Larven. Wiederholen Sie diesen Aufnahme jeden Tag, bis alle Larven sterben oder verpuppen und sich als Erwachsene. Nehmen die Größe Larven jeden zweiten Tag, das heißt Tag 0, 2, 4, 6, 8, bis sie Verpuppung.
- Analysieren Sie die Entwicklung der Larven und Mortalitätsdaten mit einem geeigneten statistischen Analyse-Software.
HINWEIS: Ein Balkendiagramm können die Mortalitätsdaten in Microsoft Excel darzustellen. Multivariate Varianzanalyse (MANOVA) durchgeführt mit einer Software wie JMP oder SPSS wird zeigen, wenn verschiedene Dosen des Medikaments in signifikant das Überleben von Moskitolarven führen.
2. Fecundity Assay durch Verabreichung Drug durch künstliche Zufuhr an weiblichen Mücken
HINWEIS: In diesem Abschnitt werden die Zugabe des Medikaments, um Blut einnd Verfütterung an erwachsenen weiblichen Moskitos mit einem künstlichen Feedersystem.
- Einrichtung für Erwachsene Moskitokäfige mit gleicher Anzahl von männlichen und weiblichen Mücken für Kontroll- und Testkäfig. Geben Sie 10% Zuckerlösung in Watte, sowohl den Käfigen, bis die Weibchen getränkt sind bereit für die Zuführung (3-5 Tage ist optimal für Anopheles gambiae).
- 2 Stunden vor der blutsaugenden, entfernen Sie die Baumwollkugeln, um sicherzustellen, Weibchen sind hungrig.
- Montieren Sie zwei künstliche Blut Anleger, die eines umgekehrten breiten unteren Glastrichter (Durchmesser = 50 mm, Länge = 70 mm) und einem umgebenden Kunststoff mit Industriekleber versiegelt bestehen. Befestigen Plastikröhrchen (Durchmesser = 7 mm), um zwei Zuführungen 'Auslässe (Durchmesser = 10 mm) über Anschlüsse für Zu- und Abfluss von Wasser. Beschriften Sie die zwei Zuführungen als "Control" und "5 uM DZNep."
- Mit einem handelsüblichen Heizelement, das Programm für die Fütterung eingestellt. In "Menü", wählen Sie "Einstellungen"und wählen Sie "Sollwerte"; vorinstallierte Programme wird angezeigt. Wählen Sie "SP1" und stellen Sie die Temperatur für 37 ° C.
HINWEIS: Der Heizkörper wird sichergestellt, daß das Blut verabreicht wird, bei einer konstanten Temperatur gehalten wird. Zusätzliche Programmeinstellungen können für verschiedene Moskito oder Insektenarten verwendet werden. - Füllen Sie einen Eimer mit Wasser und tauchen Sie das Heizelement in das Wasser.
- Schneiden Sie ein Quadrat Stück Parafilm (50 mm x 50 mm), und ziehen Sie es, um eine dünne membranöse Film zu machen. Bedecken Sie den Boden der künstlichen Anleger, die mit dem Parafilm. Schneiden Sie ein Stück Parafilm (50 mm x 10 mm), ziehen Sie es und die Ränder der Anleger.
- Bauen Sie das System, den Anschluss der Zuleitungen und Heizelement durch die Rohre. Einmal abgeschlossen, schalten Sie das System und wählen Sie "SP1". Drücken Sie auf "Enter", um das System zu starten.
HINWEIS: Das Wasser wird auf 37 zu bekommen beheizt ° C und bei dieser Temperatur gehalten. - Überwachen the Temperatur des Wassers mit einem Thermometer in den Wassereimer.
HINWEIS: Die Anschlüsse und Rohre zur Aufrechterhaltung eines konstanten Zirkulation des Wassers durch das System, so dass die Temperatur des Blutes bei 37 bleibt ° C. - Füllen Sie eine flache Bodenschale mit 10% Bleichmittel-Lösung, die verwendet werden, um irgendwelche Blutverschmutzungen dekontaminiert werden.
- 2 ml defibrilliert Schafblut zu einem Reaktionsgefäß. Kennzeichnen Sie diese als "Control". Wiederholen Sie den Vorgang für die Versuchsröhre als "5 uM DZNep" .Add 6 ul der DZNep Stammlösung (siehe Punkt 1.5) in die Versuchsröhre mit "5 uM DZNep" gekennzeichnet mischen Sie vorsichtig das Blut und Drogen durch Umdrehen es mehrmals. Das Röhrchen 10 min bei RT.
- Mit einer Pipette 2 ml Kontroll- und Test Blut an die Spitze der entsprechend bezeichneten Anleger. Entsorgen Sie die Pipette in der Bleichlösung. Bedecken Sie den Käfig mit einem dunklen Tasche und atmen Luft am Käfig regelmäßig, um f fördernemales für die Fütterung.
- Lassen Sie die Mücken ernähren ca. 30 min. Nach Zuführung abgeschlossen ist, schalten Sie das Heizelement, nehmen die Anleger aus und schneidet den Parafilm. Weichen Sie die Zuführung in Bleichlösung etwa 5 Minuten und spülen Sie gut in VE-Wasser.
- Entfernen Sie die Feeder und legte Watte mit Zuckerwasser auf den Käfigen für 48 Stunden. Ein Eierspeise Wasser und Filterpapier, das in den Käfigen über Nacht auf die Eiablage zu erleichtern. Beschriften Sie jedes Eierspeise mit der jeweiligen Test- oder Kontroll Konzentration.
- Entfernen Sie die Eierspeise nächsten Tag und untersuchen Sie die Anzahl und Struktur der Eier unter einem Stereomikroskop. Besorgen Sie Bilder mit der Q-colors5 Software. Die Anzahl der Eier. Analysieren Unterschied in der Anzahl von Eiern von Test- und Kontrollkäfigen erhalten.
HINWEIS: Ein ungepaarter t-Test kann verwendet werden, um festzustellen, ob die Zahl der Eier signifikant unterschiedlich (p ≤0.05) gestellt sind.
3. Biochemische Assay von Mosquito Enzyme Inhibitionvon Drug
HINWEIS: In diesem Abschnitt wird ein Enzym-Aktivitätstest unter Verwendung von DTNB als Indikator, um den Effekt auf DZNep SAH Hydrolase Hemmung in erwachsene männliche und weibliche Mücken bestimmen.
- Vorbereiten einer 0,1 M Na 2 HPO 4 (dibasisches Natriumphosphat) Lösung durch Zugabe von 14,19 g Na 2 HPO 4 zu 1 l dH 2 O. Als nächstes bereiten eine 0,1 M NaH 2 PO 4 (Natriumdihydrogenphosphat) Lösung durch Zugabe von 13,79 g NaH 2 PO 4 zu 1 l dH 2 O.
- Daraufhin wird die 0,1 M Na 2 HPO 4 -Lösung mit 0,1 M NaH 2 PO 4 -Lösung auf pH 8,5.
Hinweis: das wird die Arbeitsstammlösung von 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) sein. - Vorbereiten einer Homogenisierung Lösung von 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) durch Zugabe von 0,3% Triton X-100.
HINWEIS: Die Homogenisierung Lösung kann bei 4 ° C gelagert werden - Prepare ein 1,6 mM SAH (MW = 384,4) durch Auflösen von 6,15 mg von SAH in 10 ml 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5).
- Vorbereiten einer 1,6 mM DTNB (MW = 396,4) durch Auflösen von 6,3 mg DTNB in 10 ml 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5). Halten Sie die frische DTNB-Lösung auf Eis bis zum Gebrauch.
- Bereiten Sie eine 1 mM DZNep.HCl (MW = 298,73) durch Lösen von 0,3 mg DZNep in 1 ml dH 2 O Weiter verdünnt man das 1 mM DZNep Lösung in einer Reihe von Konzentrationen von 1,000 & mgr; M bis 0,002 & mgr; M in dH 2 O.
- Um die SAH-Hydrolase-Hemmung durch DZNep messen, bereiten eine Rohenzymextrakt Mücken: homogenisieren 10 Nicht-Blut-fed erwachsenen Mücken in 1 ml eiskaltem 0,1 M NaH 2 PO 4 (pH 8,5), das 0,3% Triton X- 100, mit einem Glas Gewebehomogenisator. Übertragen Sie das Homogenat zu einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Zentrifugieren des Homogenats für 5 Minuten bei 10.000 × g bei 4 ° C. Den Überstand in ein sauberes1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Verwenden der Überstand als Enzymquelle für die SAH biochemischen Assays.
- Für die Blindbehandlung (dh keine DZNep kein Enzym) werden 50 & mgr; l 1,6 mM SAH, 50 ul 1,6 mM DTNB, und 100 & mgr; l 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) auf die einzelnen Vertiefungen einer 96-well, Flachboden-Mikrotiterplatte.
- Für die Kontrolle (dh, kein DZNep) werden 50 & mgr; l 1,6 mM SAH, 50 ul 1,6 mM DTNB, 50 & mgr; l 0,1 M Na 2 HPO 4 (pH 8,5) und 50 ul Enzym (SAH Hydrolase aus Rohextrakt) erhaltenen Individuums Brunnen.
- Für DZNep Behandlungen, fügen Sie 50 ul 1,6 mM SAH, 50 ul 1,6 mM DTNB, 50 ul Enzym und 50 ul ausgewählt DZNep Konzentration auf einzelne Vertiefungen. Bereiten Sie 4 Wiederholungen pro Behandlung und Kontrolle.
- Lesen der optischen Dichte (OD) der SAH Enzymproben bei 405 nm für 5 Minuten bei 20 s Intervallen unter Verwendung eines 96-Well-Mikrotiterplatten-Lesegerät.
- Die OD des Leer OD von Steuer einnd Behandlung OD von jedem erhalten gut. Berechnen der verbleibenden SAH-Hydrolase-Aktivität unter Verwendung der folgenden Gleichung Prozent:% Restaktivität = (OD Behandlung / Kontrolle OD) × 100.
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Representative Results
Figur 1 ist eine schematische Darstellung der Assays; es die verschiedenen Schritte des in diesem Artikel genannten Verfahren beschreibt. Da das Protokoll auf die verschiedenen Lebensstadien Mücken basiert, gibt es keine besondere Reihenfolge für die Experimente detailliert hier folgen. Der Benutzer kann wählen, einen oder mehrere Assays gleichzeitig durchzuführen, je nach Proben Verfügbarkeit.
Abbildung 2 zeigt die für den unreifen Moskitos Entwicklung und Überlebensassays setzen Platte. Die Zahl der Testkonzentrationen und Wiederholungen können je nach den Anforderungen des Anwenders und Drogen Verfügbarkeit ändern. Für die unreifen Moskitos Assay wurde 1 mM Stammlösung von DZNep enthaltendem Wasser Mücken, um eine Endkonzentration von 0,5 & mgr; M und 5 & mgr; M sowie ein Kontrollschale mit Vertiefungen, die eine arzneimittelfreie Population erreichen zugegeben. Das Experiment zeigte, daß mehr Larven und Puppen survin den Kontrollvertiefungen als in den DZNep-behandelten Vertiefungen Ived.
Abbildung 3 zeigt die Wirkung eines DZNep auf Gesamtüberleben von Malaria Moskitos während des Experiments. Die Ergebnisse zeigen, dass die epigenetische Arzneimittel DZNep drückt das Wachstum und die Entwicklung und induziert die Mortalität von unreifen Moskitos. Die Mehrheit der Mücke bis 0,5 um belichtet zu Tag 10 des Versuchs gestorben, während eine große Anzahl von Individuen zu 5 & mgr; M ausgesetzt an Tag 8 starben dagegen die Mortalität der Mücken in der Kontrollbehandlung (kein Medikament) blieb unberührt und mehrere entstand als Erwachsene am 8. Tag des Experiments. Eine umgekehrte Beziehung wurde zwischen Arzneimittelkonzentration und Mückenkörpergröße (Abbildung 4) beobachtet.
Abbildung 5 zeigt die Wirkung der DZNep auf Moskito Fruchtbarkeit. Erwachsene weibliche Moskitos mit Blut enthält DZNep gefüttert eine signifikante reduction in der Anzahl von lebensfähigen Eiern. 5A zeigt Eier von Steuerkäfig (kein Arzneimittel) erhalten. 5B zeigt die von der Testkäfig erhaltenen Eier. Eine große Anzahl von Eiern von Testkäfig erhalten waren in der Farbe dunkler, und es fehlte Schwimmer (luftgefüllte Ausdehnungen exochorion), wenn mit Eiern von normalen Blutgespeisten weibliche Moskitos (Figur 6) verglichen. Das Fehlen der Schwimmer zusammen mit dunkler gefärbten Eiern gibt die mögliche Rolle der Epigenetik in exochorion Bildung.
Abbildung 7 zeigt die Wirkung DZNep auf SAH-Hydrolase-Aktivität in erwachsene männliche und weibliche Malariamücken. A DZNep abhängige Abnahme der OD für jede Arzneimittelbehandlung im Vergleich zu der Kontrollbehandlung (kein Arzneimittel), die anzeigt, dass DZNep hemmt SAH-Hydrolase-Aktivität beobachtet.
Abb. 1: Schematische Darstellung des Tests unter Verwendung von eine epigenetische Medikament auf Malariamücken Der linke Teil des Programms sind die Entwicklung und Überlebensassays unter Verwendung von unreifen Moskitos. Der mittlere Teil zeigt die Fruchtbarkeit Test über blutsaugende das Medikament zu erwachsenen Frauen. Der rechte Teil zeigt den biochemischen Test der Enzymhemmung durch das Medikament.
Abbildung 2: Platte der Darstellung der unreife Moskito Entwicklung und Überlebensassay Beschriften Sie "C" Marken Kontrollvertiefungen.. Label "0.5" zeigt Wells mit 0,5 uM DZNep. Label "5" gibt an Brunnen mit 5 uM DZNep.
Abbildung 3: Wirkung von DZNep auf Hinterbliebenen der Malaria-Mücken. Konzentrationsabhängige Mortalität mit unreifen Moskitos beobachtet.
Abbildung 4:... Wirkung von DZNep auf die Entwicklung von unreifen Moskitos (A) Larve aus der Kontrollbehandlung (Größe = 5 mm) (B) Larve mit 0,5 uM DZNep (Größe = 4 mm) (C) Larve behandelt mit 5 behandelt uM DZNep (size = 3 mm). Alle Larven wurden am selben Tag des Experiments gemessen.
Abb. 5: Einfluss der DZNep auf Moskito Fruchtbarkeit Eiergericht aus der Kontrollbehandlung (kein Arzneimittel) Mücken enthält viel größere Anzahl von Eiern (A) comparot mit dem Eierspeise der Weibchen mit 5 uM DZNep (B) behandelt.
Abbildung 6: Wirkung von DZNep auf Ei-Struktur in Malariamücken unter dem Mikroskop. (A) Eier aus der Kontrollbehandlung (keine Drogen) Mücken angezeigt Schwimmer und rosettenartigen Baugruppen. (B) Eier von den mit 5 uM DZNep fehlt Schwimmer und rosettenartigen Baugruppen behandelt Mücken.
Fig. 7: SAH Hydrolase Hemmung durch DZNep in Malaria-Mücken DZNep bewirkt eine Abnahme der OD, verglichen mit Kontrollbehandlung (kein Arzneimittel).
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Discussion
Es gibt mehrere Schritte für die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls. Für die Larventest sollte darauf geachtet werden, um korrekt zu kennzeichnen und zu replizieren jede Testkonzentration werden. Randomisierung von Proben und das Hinzufügen der benannten Menge des Arzneimittels an die jeweiligen Testbrunnen ist ein wichtiger Teil dieser Versuchsanordnung. Vor der Zugabe der 2. Larvenstadium von Moskitolarven in eine 96-Well-Mikroplatte, kann jede Larve auf einem Papiertuch für 2-3 sec gesetzt, um überschüssiges Wasser zu entfernen. , Um ein Austrocknen zu verhindern, muss Larven sofort an die Mikrotitervertiefungen mit einem stumpfen Pinzette übertragen werden. Dies gewährleistet die Wassermenge in jeder Mikroplattenvertiefung und die Konzentration des Medikaments vor, wie beabsichtigt. Bei der Übertragung von Larven zur Messung ihrer Körperlänge, ist es empfehlenswert, die Larven auf Eis für einige Minuten, um sie stationär zu halten setzen. Bei der Anpassung dieses Protokoll für eine andere Verbindung, sollte darauf geachtet werden, die Menge der Stammlösung in jede Vertiefung gegeben bestimmengut. In solchen Fällen kann es besser sein, die berechnete Menge an Verbindung in Wasser unmittelbar vor der Zugabe der Larven in jeder Mikro gut lösen.
Für Blutfütterungstests, ist es wichtig, dass Moskitos werden in geeigneter Weise durch die Beseitigung Zuckerwasser mindestens 2 Stunden vor dem Experiment verhungert. Bei Nichtbeachtung kann zu einer unvollständigen Ernährung und wenig Einfluss auf die weiblichen Eierproduktion Erwachsenen führen. Eine gute Durchmischung und eine gleichmäßige Verteilung des Arzneimittels im Blut ist ein wichtiger Schritt, als auch, wie DZNep dauert ein paar Minuten, sich aufzulösen. Wenn das Medikament behandelte Blut wird unmittelbar zugeführt, DZNep nicht gleichmäßig in der Moskito-System verteilt zu werden. Es wird dringend empfohlen, dass der defibrilliert Blut ist frisch (dh weniger als eine Woche, da Extraktion Datum) für bessere Ergebnisse.
Es gibt mehrere Schritte, die für den Erfolg eines biochemischen Assays mit einer Verbindung von Interesse. Konzentrationen jeder Stammlösung in dieser proto benutzt col seit DZNep optimiert. Um das Protokoll für eine andere Verbindung anpassen, empfehlen wir testen eine Reihe von verschiedenen pH, SAH, DTNB Konzentrationen und Insektenstichprobengrößen, die zuverlässigsten Ergebnisse zu bestimmen. Herstellung der rohen Enzymextrakt ist der zeitaufwendigste Schritt bei diesem Verfahren. Während Homogenat Herstellung empfiehlt es sich, nicht mehr als 10 erwachsene Moskitos im Überstand kann Extinktionsablesung behindern Lipide verwenden. Um dieses Problem zu vermeiden, kann die oberste Schicht der Lipide in dem Überstand (unter Verwendung eines einzelnen Kanalpipette) nach Schritt 3.8 entfernt werden. Überstand muss auf eine saubere Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Schritt 3.8 wiederholt werden sollte, um alle verbleibenden viskosen Lipide zu verwerfen. Die verbleibende klare Überstand muss von allen Rohren gesammelt und vorsichtig gemischt werden. Ein Mehrkanal-Pipette für erhöhte Leistungsfähigkeit verwendet werden, um SAH in den Wells hinzu. DTNB wird als Indikator in dem Assay verwendet wird, und sollte letzten hergestellt und auf Eis gehalten werden.
nt "> Dieses Protokoll stellt dem Benutzer einfache Schritte, die Wirkungen einer Verbindung auf verschiedenen Lebensstadien von Moskitos zu testen. Es gibt jedoch einige Einschränkungen auf die Verwendung dieses Protokolls. Diese Technik hängt primär von der Wasserlöslichkeit DZNep. Unreife Larven zum Medikament in der sie umgebenden Medien gelöst ausgesetzt ist. Wenn die zu testende Verbindung wird in einem wässrigen Medium unlöslich ist, kann es machen dieses Protokoll weniger effizient. Zum Testen der Fruchtbarkeit, unterzogen wir die adulten Weibchen zu Medikament in defibrilliert Schafsblut aufgelöst. Diese wäre nicht möglich, wenn ein Labor erhebt Moskito Kolonien auf Säugetierblut direkt (dh verwendet Mäuse oder Meerschweinchen zur Zuführung Mücken).Die Kombination von verschiedenen Assays in diesem Artikel beschrieben bietet dem Benutzer eine neue Möglichkeit zum Testen der Wirkungen einer wasserlöslichen Verbindung von Insekten. DZNep meist auf Zellinien in vitro für die Krebsforschung gegeben; aber dieses Protokoll ermöglicht die user keine Auswirkungen auf verschiedenen Lebensphasen eines Insekts in vivo zu untersuchen. Zusätzlich bietet er auch die Forscher mit Schritt-für-Schritt-Anweisungen für toxikologische Tests. In der aktuellen Literatur wird das Wissen im Hinblick auf die Auswirkungen von Medikamenten auf epigenetische Insekten beschränkt. Mit DZNep als Beispiel, stellen wir ein Verfahren, das als Voraussetzung Schritt zur Erforschung anderer epigenetischer Medikamente oder neue Verbindungen als potentielle Insektenbekämpfungsmittel verwendet werden kann. Obwohl dieses Protokoll der Malariamücke entwickelt, kann es geeignet ist, die Wirkung der DZNep oder jede wasserlösliche Verbindung von Interesse, in anderen Mücke oder Insektenarten zu testen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
| Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
| Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
| Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ | |
| DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
| DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
| Egg dish cups | |||
| Filter papers | Fisher | 09-795E | |
| Glass feeders | Virginia Tech | ||
| Glass tissue homogenizer | |||
| Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
| Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
| Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
| Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
| Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
| Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
| NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
| pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
| Plate reader | Spectramax | M2 | |
| SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |
References
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