Method Article

말라리아 모기의 개발, 다산과 생존자에 성적인 의약품의 시험 효과에 대한 독성 시험 법

DOI:

10.3791/52041

⸱

January 16th, 2015

 ,  , 
1Department of Entomology, Virginia Tech

In This Article

Summary

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모기의 발달, 번식력 및 생존에 대한 후성유전학적 약물 DZNep의 효과를 조사하기 위한 프로토콜이 개발되었습니다. 여기에서는 SAH 가수분해효소 억제를 측정하는 것 외에도 미성숙 모기에 대한 DZNep의 수성 노출 및 성체 모기에 대한 DZNep의 혈액 기반 노출 절차를 설명합니다.

Abstract

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살충 저항은 말라리아 제어 프로그램의 주요 문제가있다. 모기는 말라리아는 열대 지방에 편재하는 문제를 제어하게 신속 환경에서 다양한 변화에 적응. 살충제 내성 인구의 출현은 벡터 모기 제어를위한 새로운 약물 표적 경로 및 화합물의 탐사를 보증합니다. 성적인 약은 잘하지만 많은 곤충에 미치는 영향에 대해 알려진하지, 암 연구에 설립된다. 이 연구는 말라리아 벡터,과 아노 펠 레스 gambiae에, 3 Deazaneplanocin (DZNep), 암 치료를위한 실험 후생 유전 학적 약물의 독성 학적 효과를 조사하기위한 간단한 프로토콜을 제공합니다. 화합물이 치료를 컨트롤을 기준으로 성인 모기의 번식력을 감소하는 반면 사망률과 크기의 감소에서 농도 의존적​​ 증가는 DZNep에 노출 미숙 한 모기에서 관찰되었다. 또한, S의 약물 의존적 감소가 있었다 -치료를 제어 할 수 DZNep 상대에 노출 된 후 모기에 adenosylhomocysteine​​ (SAH) 가수 분해 효소 활동. 이러한 프로토콜은 차례로, 수용성 후생 유전 학적 약물 또는 화합물의 독성 학적 효과를 탐험 독특한 멀티 프롱 접근법을 설명, 실험 약물 여러 독성 엔드 포인트를 평가하는 간단한 단계별 절차 연구원 제공 벡터 모기와 다른 곤충에 대한 관심.

Introduction

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말라리아는 세계의 곤충 관련 사망의 가장 많은 책임이있다. 추정 219,000,000가지 경우는 주로 아프리카 1 약 660,000 죽음의 결과로, 매년 전세계에서 발생합니다. 공동의 노력에도 불구하고, 말라리아 프로그램은 몇 가지 도전에 직면하고 있습니다. 살충 처리 bednets 프로그램 실내 잔류 분사 형태 키 구성 요소는 로컬 인구 살충제에 대한 내성이 이러한 노력을 방해한다. 살충제 저항성 모기 인구의 급속한 증가는 주로 자신의 환경 변화에 신속하게 적응하고 다른 틈새 3,4,5을 악용 할 수있는 말라리아 모기의 능력에 기인한다. 살충제 내성 기존 메커니즘을 극복하기 위해, 신규 살충제 대상 및 차세대 화합물의 탐사가 보증된다. 말라리아 m의 다양한 수명 단계에서 실험 살충제의 효능을 결정하기위한 간단한 단계별 프로토콜osquitoes 크게 이러한 노력을 강화한다.

세포주 및 동물 모델에서 약물 효과의 약리 연구는 세포 및 유기체의 유전 및 생리를 조절하는 데 유용한 도구로 후생 유전 학적 약물의 사용을 설립했다. DNA 메틸화 및 히스톤 변형은 하부 DNA 서열 (6)을 변경하지 않고 다세포 생물의 유전자 발현에 영향을 미치는 후생....

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Protocol

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참고 : 프로토콜의 세 부분 유충 모기, 다산의 효과를 연구하는 성인 여성에 DZNep의 혈액 기반의 노출 DZNep 약물의 수성 노출을 설명하고 DZNep에 의해 SAH 가수 분해 효소 억제는 간단한 비색 기술을 사용하여 측정 하였다. 상기 분석의 개략도는도 1에 도시된다.

1. 미성숙 모기 개발 및 생존자 분석 실험

참고 :이 섹션에서는 모기 유충 개발 및 생존에 영향을 미치는 수용성 약물의 사용을 설명합니다.

  1. 해치 A. 28 ° 증류수 C DH (2 O) 및 후면 그들에게 2 차의 령 유충에서 gambiae 계란.
  2. 여섯 웰의 DNase, RNAse가없는 세포 배양 접시를 타고 각 웰에 10 ml의 dH보다 2 O를 붓는다.
  3. 2 차의 령에 모기 유충을 선택하고 잘 당 15 애벌레를 추가합니다. 판에 2 차의 령 유충을 추가하기 전에, P여분의 물을 제거하기 위해 2 ~ 3 초 동안 종이 타월에 그들을 UT.
  4. 컬러 코딩 테이프와 라벨 우물은 실험을 랜덤합니....

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Results

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도 1은 분석의 개략도이다; 그것은이 문서에 나와있는 절차의 다양한 단계를 설명합니다. 프로토콜이 모기의 서로 다른 삶의 단계를 기반으로, 여기에 설명 된 실험에 따라야 할 특별한 순서가 없습니다. 사용자는 표본의 가용성에 따라, 동시에 하나 이상의 분석법을 수행하도록 선택할 수있다.

그림 2는 미성숙 모기 개발 및 생존 분석에 대해 설정 한 판을 보여줍니다. 시험 농도 및 반복 실험의 수는 사용자의 요구 및 약물의 가용성에 따라 변경 될 수있다. 미성숙 모기 분석에서, DZNep 1 mM의 스톡 용액을 0.5 μM 및 약물없는 인구 함유 웰과 제어 팬과 함께 5 μM의 최종 농도를 달성하기 위해 모기를 함유하는 물에 첨가 하였다. 실험은 입증이 더 유충과 번데기의 survDZNep 처리 된 우물에 비해 제어 우물에 ived.

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Discussion

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이 프로토콜의 성공적인 응용 프로그램에 중요한 몇 가지 단계가 있습니다. 유생 분석에서,주의 라벨을 정확하게하고 각 시험 농도를 복제 취해 져야한다. 테스트 샘플을 무작위 화하고 각각의 테스트 우물에 약물의 지정된 금액을 추가하면 설정이 실험의 중요한 부분입니다. 96 웰 마이크로 플레이트에 2 차 령 모기 유충을 추가하기 전에, 각 유충은 여분의 물을 제거하기 위해 2 ~ 3 초 동안 종이 타월에 배치 할 수 있습니다. 탈수를 방지하기 위해, 유충은 즉시 집게의 무딘 쌍을 사용하여 마이크로 우물에 전송해야합니다. 이는 각 웰 마이크로 플레이트에서 물의 양을 보장하고 의도 된 약물의 농도는 유지된다. 자신의 몸 길이를 측정하는 유충을 전송하는 경우, 그것은 고정을 유지하기 위해 몇 분 동안 얼음에 애벌레를 넣어하는 것이 좋습니다. 다른 화합물은이 프로토콜을 채택 할 경우, 각 케어 첨가 스톡 용액의 양을 결정하기 위해 취해 져야한다잘. 이러한 경우, 종래 직접 각 웰 마이크로 플레이트에서 유충을 물에 첨가 .......

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Disclosures

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저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgements

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DZNep.HCl을 제공해 준 Victor Marquez와 혈액 공급기를 제작해 준 Scotty Bolling에게 감사드립니다. An. gambiae의 Mopti 및 SUA2La 균주는 Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4)에서 얻었습니다. 이 연구는 Fralin Life Science Institute와 National Institutes of Health 1R21AI094289의 Igor V. Sharakhov에 대한 보조금의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96웰 마이크로플레이트Fisher Scientific12565561
세포 배양 플레이트CytoOneCC7682-7506
원심분리기Sorvall 프레스코76003758다른 원심분리기 사용 가능
컬러 테이프 롤FisherS68134
해부 현미경OlympusSZ
DTNBSigma AldrichD8130
DZNep.HClSigma AldrichSMLO305
계란 접시 컵
여과지Fisher09-795E
유리 공급기Virginia Tech
유리 조직 균질화 장치
발열체Fisher ScientificNC0520091
인큐베이터Percival scientificI36VLC8다른 인큐베이터를 사용할 수 있습니다
마이크로센트리퓨지 튜브, 2  mlAxygen22-283
마이크로 원심분리기 튜브, 1.5  mlAxygenMCT-150-C
마이크로피펫Eppendorf4910 000.069
Na2HPO4Fisher ScientificM-3154
NaH2PO4Fisher ScientificM-8643
pH 미터 Mettler Toledo 7easyS20
플레이트 리더SpectramaxM2
SAHSigma AldrichA9384-20 °에 보관; C
트리톤 X-100시그마 알드리치T8787
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References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. CDC Report. , Available from: http://www.cdc.gov/malaria (2010).
  2. Gatton, M. L., et al. The importance of mosquito behavioural adaptations to malaria control in Africa. Evolution; International Journal of Organic Evolution. 67, 1218-1230 (2013).
  3. Sternberg, E. D., Thomas, M. B.

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Epigenetic DrugMalaria MosquitoToxicological AssaysDZNep TreatmentLarval MortalityFecundity AssaySAH HydrolaseEnzyme ActivityBlood FeedingMosquito Survivorship

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