In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.
Hier presenteren we een protocol voor de bereiding van acute hersenen plakjes. Deze procedure is een essentieel element voor elektrofysiologische patch-clamp experimenten die in sterke mate de kwaliteit van de resultaten. Het is aangetoond dat het weglaten van de koelstap tijdens het snijden procedure voordelig verkrijgen gezonde segmenten en cellen, vooral dan wanneer het zeer myeline hersenstructuren van volwassen dieren. Hoewel het precieze mechanisme waarbij verhoogde temperatuur ondersteunt neurale gezondheid kan alleen worden gespeculeerd, is het logisch dat, waar mogelijk, de temperatuur waarbij het snijden wordt uitgevoerd moet dicht bij fysiologische omstandigheden voor temperatuur gerelateerde artefacten te voorkomen. Een ander belangrijk voordeel van deze methode is de eenvoud van de procedure en derhalve de korte bereidingstijd. In de aangetoonde werkwijze volwassen muizen worden gebruikt, maar dezelfde procedure kan worden toegepast jongere muizen en ratten. Ook de volgende patch clamp experiment wordt uitgevoerd op horizontale cerebellaire segmenten, maar dezelfde procedure kan ook worden gebruikt in andere vlakken en andere posterieure gebieden van de hersenen.
Doel van de gepresenteerde methode is om hoogwaardige acute hersencoupes verkrijgen voor in vitro elektrofysiologische experimenten, zeker bij volwassenen of oudere dieren.
De acute brain slicing methode, zoals beschreven door Skrede en Westgaard 1 in twee elegante zinnen, is uitgegroeid tot een van de fundamenten van de moderne neurowetenschappen onderzoek en wordt gebruikt in talloze variaties wereldwijd. De kwaliteit van de segmenten wordt weerspiegeld in aantal levende neuronen per segment, de periode gedurende welke de cellen behouden hun elektrofysiologische en morfologische eigenschappen en de integriteit van het weefsel. Bovendien is de maximale stabiele opnames afhankelijk van de kwaliteit van de segmenten. Aldus langs de decennia de oorspronkelijke snijden methode is verder ontwikkeld door afzonderlijke onderzoeksgroepen plak herstel verbeteren na het snijden 2-10, vaak door complexe veranderingen van de samenstelling van het snijden or recovery oplossingen (zoals het toevoegen ascorbaat, thioureum of H 2 O 2) en intra-cardiale pre-perfusie van de dieren met gekoelde fysiologische oplossingen.
Zoals onlangs aangetoond 11, fysiologische temperatuur tijdens snijden lijkt gunstiger dan afkoelen tot neuronale gezondheid zijn; de verbetering is het meest opvallend bij het werken met volwassen (2-8 maand) knaagdieren. Het vermijden dramatische veranderingen temperatuur staat artefacten vanwege temperatuurafhankelijke processen in de cellen, zoals plasticiteit 13 en ionkanalen kinetiek 13,14. Dergelijke veranderingen kunnen membraan spanning en intracellulaire calcium signalering, spike drempel beïnvloeden, en spike vorm.
De "hot" acute slice voorbereiding hier gepresenteerde methode is een algemene procedure voor het verkrijgen van hoogwaardige acute hersenen plakjes vanaf elke regio hersenen, waaronder de kleine hersenen, de cortex en de hippocampus, hersenstamkernen 16 </ Sup> en de bulbus olfactorius, zowel in ratten en muizen.
Met name de fysiologische temperatuur slicing procedure vereist dat het snijmes trilt bijna perfect horizontaal en is zonder enige structurele defecten. Zulke precisie is misschien niet haalbaar met oudere snijmachine modellen zijn; in dergelijke gevallen raadzaam uitvoeren van de slice preparaat ijskoude omstandigheden als lage temperaturen lijkt het weefsel beter bestand tegen mechanische beschadiging, zelfs indien de kosten van metabole afwijkingen maken.
We tonen een werkwijze voor het bereiden van acute hersencoupes van muizen in fysiologische plaats ijskoude temperatuur.
Aangetoond is 11 dat de kwaliteit van de verkregen schijfjes warm blijft superieur vergeleken met die bereid met koude omstandigheden, mits de snijmachine mes heeft minimale verticale trillingen. Slicing in fysiologische temperatuur kunnen fysiologische artefacten veroorzaakt door de lage temperatuur, zoals die met betrekking tot veranderingen in de metabole pro…
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge the significant contribution Dr. Shiwei Huang (Australian National University) in validating the method. Furthermore, we would like to thank Ms. Kasia Pietrajtis for helpful comments regarding Golgi cells and Mr. Vitaly Lerner for the cortex experimental data. This work was supported by PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC and ISF.
Name | Company | Catalog # | Comments |
Pentobarbital | CTS | 170066 | Concentration: 60 mg / ml in physiological saline. |
Big scissors | FST | 14001-16 | Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation |
Iris scissors | Prestige medical | 48,148 | Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5 – 2 cm |
Fine tip forceps | FST | 11254-20 | |
Scalpel | FST | 91003-12 | |
Scalpel blade #11 | FST | 10011-00 | |
Small spatula | Fisher | 2350 | |
Filter paper | Any laboratory brand can be used. | ||
Petri dishes | Duroplan | Z231509-1 | |
Glass beakers | SCHOT | 10022846 | |
Pasteur pipette | Maple Leaf Brand | 14672-029 | |
Super glue | LOCTITE | 4091361/1 | |
Slicer | Campden | 7000-smz | |
Ceramic slicing blade | Campden | 7550-1-C | |
Magnetic heater/stirrer | For heating up the SPS for the procedure | ||
Electric kettle | For heating up water for temperature control | ||
Slice recovery chamber + heating unit | Warner instruments | BSC-HT + BSC-BUW | Home-built models may also be used. |
Thermometer | For monitoring SPS temperature during dissection and slicing |