Summary

スライスこれホット:生理的温度における急性成人の脳スライス

Published: October 30, 2014
doi:

Summary

In this paper we show a method for preparing acute brain slices in physiological temperature, using a conventional physiological solution without special modifications for the cutting (such as adding sucrose) and without intracardial perfusion of the animal before slice preparation.

Abstract

ここでは、急性脳スライスを調製するためのプロトコルを提示する。この手順は、主に、結果の品質を決定する電気生理学的パッチクランプ実験のための重要な要素である。これは、成熟した動物からの高度髄脳構造を扱う場合は特に、手順を切削中に冷却工程を省略すると、健康なスライスおよび細胞を得るのに有益であることが示されている。上昇した温度のみに依存推測することができ、神経の健康をサポートすることにより、正確なメカニズムは、それはそれを理にかなっていても、可能な限り、スライシングが行われる温度は、温度関連のアーティファクトを防止するために、生理学的条件に近づけるべきである。この方法の別の重要な利点は、手順の単純さと、したがって、短い準備時間である。実証の方法では、成体マウスが使用されているが、同じ手順が若いマウスならびにラットに適用することができる。また、以下のパッチCLアンプ実験は、水平小脳切片上で実行されるが、同じ手順は、他の面と同様に、脳の他の後方の領域で使用することができる。

Introduction

提示された方法の目的は、特に大人や古い動物を使用した場合、 インビトロ電気生理学的実験のために高品質の急性脳スライスを得ることである。

2エレガントな文章にSkredeとWestgaard 1に記載されているように急性脳スライス方法は、現代の神経科学研究の基礎となっており、世界中の無数のバリエーションで使用される。スライスの品質は、スライス当たりの生きているニューロンの数、細胞は電気生理学的および形態学的特性を保持し、ならびに組織の完全でない期間に反映される。また、安定した録画の最大の持続時間は、スライスの品質に依存します。このように、数十年に沿って、元のスライス方法は、さらに多くの場合、Oの切断物の複雑な修飾により、2-10切断後のスライスの回復を強化するために、個々の研究グループによって開発された同様に冷却された生理的なソリューションと動物の心臓内プレ灌流(例えばアスコルビン酸、チオ尿素あるいはH 2 O 2の追加など)ここで、rリカバリソリューション。

最近11が示されているように、スライス時の生理的温度は、ニューロンの健康への冷却よりも有益であると思われる。大人(2-8月)げっ歯類で作業する場合の改善が最も顕著である。劇的な温度変化を回避することにより、そのような可塑13およびイオンチャネル動態13,14のような細胞内の温度依存性プロセス、アーチファクトを防止する。このような変化は、膜電位および細胞内カルシウムシグナル伝達に影響を与えるしきい値をスパイクし、スパイク形状可能性がある。

ここに提示「ホット」急性スライスの調製方法は、小脳、大脳皮質および海馬を含む任意の脳領域から高品質の急性脳スライスを得るための一般的な手順であり、脳幹核16 </ SUP>だけでなく、嗅球、両方のラット及びマウスで。

注目すべきことに、生理的温度スライス手順は、切断刃がほぼ完全に水平方向に振動し、構造的な欠陥のないことを要求する。このような精度は古いスライサーモデルと達成できない可能性があります。低温は、代謝異常のコストであっても、機械的な損傷に対する組織より耐性にいるようだとして、そのようなケースでは、我々は凍結冷条件のスライス標本を実行することをお勧めします。

Protocol

このプロトコルで説明されているすべての実験手順はヘブライ大学の動物実験委員会によって承認された。 1.スライスのためのソリューションとツールの準備 表1に記載のイオンを含有する標準生理溶液(SPS)の1リットルを準備します。 脱イオン水(0.055μS/ cmのコンダクタンス)1000mlので満たされた貯蔵ガラス瓶に予め10倍の最終濃度の塩を含…

Representative Results

記載の方法で調製したスライスは、様々な電気および光遺伝学的実験のために使用することができる。 図3A及び図3Cでは、微分干渉(DIC)光学系の下で見、それぞれ水平小脳スライス冠状大脳皮質切片の代表的な例を示している。小脳スライスでは、小脳ニューロンのいくつかのタイプを容易に目標と電気生理学的記録を可能にする、それらの位置及び細胞体形状に?…

Discussion

We demonstrate a method for preparing acute brain slices from mice in physiological instead of ice-cold temperature.

It has been shown11 that the quality of slices obtained in warm conditions is superior when compared with those prepared with cold conditions, provided that the slicer blade has minimal vertical vibration. Slicing in physiological temperature may prevent physiological artifacts caused by the low temperature, such as those related to changes in metabolic processes

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to acknowledge the significant contribution Dr. Shiwei Huang (Australian National University) in validating the method. Furthermore, we would like to thank Ms. Kasia Pietrajtis for helpful comments regarding Golgi cells and Mr. Vitaly Lerner for the cortex experimental data. This work was supported by PITN-GA-2009-238686 (CEREBNET), FP7-ICT (REALNET), ELSC and ISF.

Materials

Name Company Catalog # Comments
Pentobarbital CTS 170066 Concentration: 60 mg / ml  in physiological saline.
Big scissors  FST 14001-16 Any large scissors or a guillotine with sufficiently sharp edges can be used for decapitation 
Iris scissors  Prestige medical 48,148 Any fine tip scissors can be used, provided the scissor blades are not longer than 1.5 – 2 cm
Fine tip forceps  FST 11254-20
Scalpel  FST 91003-12
Scalpel blade #11 FST 10011-00
Small spatula  Fisher  2350
Filter paper Any laboratory brand can be used.
Petri dishes Duroplan Z231509-1
Glass beakers  SCHOT 10022846
Pasteur pipette  Maple Leaf Brand 14672-029
Super glue  LOCTITE 4091361/1
Slicer Campden 7000-smz
Ceramic slicing blade Campden 7550-1-C
Magnetic heater/stirrer For heating up the SPS for the procedure
Electric kettle For heating up water for temperature control
Slice recovery chamber + heating unit Warner instruments  BSC-HT +  BSC-BUW Home-built models may also be used.
Thermometer For monitoring SPS temperature during dissection and slicing

References

  1. Skrede, K., Westgaard, R. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Research. 35, 589-593 (1971).
  2. Aghajanian, G., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3, 331-338 (1989).
  3. Gueritaud, J. Electrical activity of rat ocular motoneurons recorded in vitro. 신경과학. 24, 837-852 (1988).
  4. Lipton, P., et al. Making the best of brain slices: comparing preparative methods. Journal of Neuroscience Methods. 59, 151-156 (1995).
  5. Richerson, G., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Experimental Neurology. 131, 133-143 (1995).
  6. Brahma, B., Forman, R., Stewart, E., Nicholson, C., Rice, M. Ascorbate inhibits edema in brain slices. Journal of Neurochemistry. 74, 1263-1270 (2000).
  7. Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-clamp techniques applied to brain slices. In: Patch-clamp analysis: advanced techniques. Springer. , 135-193 (2002).
  8. Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J. Neuroscience Methods. 156, 251-259 (2006).
  9. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).
  10. Zhao, S., et al. Cell type–specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nature Methods. 8, 745-752 (2011).
  11. Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Front. Cell. Neurosci. 7, (2013).
  12. Ohe, G. C., Darian-Smith, C., Garner, C. C., Heller, H. C. . The Journal of Neuroscience. 26 (41), 10590-10598 (2006).
  13. Voets, T., et al. The principle of temperature-dependent gating in cold- and heat-sensitive TRP channels. Nature. 430, 748-754 (2004).
  14. Coulter, D. A., Huguenard, J. R., Prince, D. A. Calcium currents in rat thalamocortical relay neurones: kinetic properties of the transient, low-threshold current. The Journal of Physiology. 414, 587-604 (1998).
  15. Gibb, A. J., Edward, F. A. Patch clamp recording from cells in slice tissues. Microelectrode Techniques: the Plymouth workshop handbook. , (1994).
  16. Lefler, Y., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Cerebellar Inhibitory Input to the Inferior Olive Decreases Electrical Coupling and Blocks Subthreshold Oscillations. Neuron. 81 (6), 1389-1400 (2014).
  17. Bourne, J. N., Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Warmer preparation of hippocampal slices prevents synapse proliferation that might obscure LTP-related structural plasticity. Neuropharmacology. 52, 55-59 (2007).
  18. Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J. Neurosci. 19, 2876-2886 (1999).
  19. Kirov, S. A., Petrak, L. J., Fiala, J. C., Harris, K. M. Dendritic spines disappear with chilling but proliferate excessively upon rewarming of mature hippocampus. 신경과학. 127, 69-80 (2004).
  20. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J. Neurosci. Methods. 171, 181-125 (2008).

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Cite This Article
Ankri, L., Yarom, Y., Uusisaari, M. Y. Slice It Hot: Acute Adult Brain Slicing in Physiological Temperature. J. Vis. Exp. (92), e52068, doi:10.3791/52068 (2014).

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