Consegna resta la sfida principale per l'attuazione terapeutico di piccoli RNA interferenti (siRNA). Questo protocollo prevede l'utilizzo di una piattaforma di distribuzione siRNA multifunzionale e biocompatibile, composto da arginina e polietilenimmina innestato microparticelle di silicio poroso.
Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.
I piccoli RNA interferenti (siRNA) sono molecole a doppio filamento di RNA che possono sopprimere l'espressione dei geni. Negli ultimi anni, siRNAs sono stati sviluppati come una nuova generazione di biofarmaci che mostrano potenziale terapeutico per uso futuro in applicazioni cliniche 1-5. Tuttavia, il successo di una terapia siRNA resta una sfida considerevole, dovuta alla degradazione da nucleasi, scarsa captazione intracellulare, bassa efficienza di trasfezione e il rilascio inefficiente dal endosome / lisosomi 5. Molti di questi ostacoli possono essere superati dallo sviluppo di piattaforme di distribuzione, che può sicuro ed efficiente fornire siRNA di tessuto malato. Rispetto ai vettori virali, le piattaforme non-virali offrono diversi vantaggi, come la sicurezza, a basso costo e facilità di sartoria. In particolare, le nanoparticelle cationici, come i polimeri e lipidi, sono dimostrate utili per la consegna siRNA 3.
In precedenza, abbiamo sviluppato un dr discoidaleug sistema di consegna, definito il vettore multistadio (MSV). Tale piattaforma è basata su fasi sequenziali, in cui un veicolo viene rilasciato da un altro. La prima fase è un veicolo a base di microparticelle biodegradabili silicio poroso (psi), mentre il secondo stadio sono veicoli nanoparticelle caricate con farmaci o agenti di contrasto 6,7. Le nanoparticelle, che sono incorporati nel materiale pSi, vengono gradualmente rilasciati come degrada il Si 8. Un vantaggio di utilizzare particelle Si è che le caratteristiche morfologiche e di superficie possono essere facilmente personalizzati per realizzare biodistribuzione ottimale e rilascio del farmaco. Recentemente, l'uso efficace della piattaforma MSV per la consegna di siRNA liposomi al tessuto tumorale è stato mostrato in un modello di topo ovarico e cancro al seno 9, 10.
In questo lavoro, abbiamo fabbricato un sistema di erogazione universale per siRNA in base ai principi della piattaforma MSV. L'efficacia di questo sistema di erogazione precedentemente us stata dimostrataing diverso siRNA molecole 11. Il sistema è un silicio poroso (PCPS) carrier policatione-funzionalizzato, consistente pSi innestato con polietilenimmina (PEI) e arginina (Arg). PEI può aiutare a formare interazioni elettrostatiche con siRNA, mentre Arg e PSI può servire per ridurre la tossicità del PEI, come precedentemente demonstarted 11. Inoltre, la presenza di PEI può aiutare nella captazione intracellulare e endosomal fuga, mentre le microparticelle psi consentono protezione siRNA e rilascio prolungato. Le particelle psi poco degradano in condizioni fisiologiche, ottenendo in tal modo la formazione di nanoparticelle Arg-PEI / siRNA (Figura 1), che hanno una morfologia distinta e una distribuzione granulometrica ristretta 11. Per maggiori dettagli riguardanti la stabilità del sistema PCPS / siRNA, fare riferimento allo studio di Shen et al. 11. Questa piattaforma PCPS differisce dal MSV convenzionale, dal momento che il secondo stadio nanoparticelle non sono inizialmente PRESEnt nel supporto, ma si formano nel tempo come carrier primo stadio degrada 11, 12. L'efficienza siRNA carico efficienza, citotossicità e silenziamento genico del sistema PCPS è stata valutata in vitro. Efficienza di trasfezione è stata misurata utilizzando siRNA contro l'atassia telangiectasia mutato (ATM) oncogene, che è coinvolto nella riparazione del DNA 10. In precedenza, la soppressione di ATM ha dimostrato di diminuire la crescita tumorale in un modello di cancro al seno 10.
Questo protocollo descrive un metodo per il successo di consegna e trasfezione di siRNA in cellule. In particolare, la fornitura di siRNA è ottenuto utilizzando una piattaforma multifunzionale costituito da particelle PSI policatione-funzionalizzato. L'uso della terapia siRNA ha un grande potenziale, per esempio, il trattamento del cancro, come i vari oncogeni possono essere mirati con alta specificità. Pertanto, esiste una domanda per sviluppare veicoli di consegna siRNA, che può attenuare le sfide dell…
The authors have nothing to disclose.
The authors acknowledge financial support from Houston Methodist Research Institute, the National Natural Science Foundation of China (Nos., 21231007 and 21121061), the Ministry of Education of China (Nos., 20100171110013 and 313058), the National Basic Research Program of China (973 Program No. 2014CB845604), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities.
Name of the Material/Equipment | Company/Institution | Catalog Number | Comments/Description |
Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | 99% |
Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
10X Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10 X Solution |
Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1X solution |
Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
Pierce LDS Sample Loading Buffer (4X) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100X) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1X |
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blor |
6X TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
Amersham ECL Western blot detection reagent. | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
4" (10cm) dia., 5x7mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (hight), provided in isopropyl alcohol | |
Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |