Poroso Silicon microparticelle per consegna di siRNA Therapeutics

Summary

Consegna resta la sfida principale per l'attuazione terapeutico di piccoli RNA interferenti (siRNA). Questo protocollo prevede l'utilizzo di una piattaforma di distribuzione siRNA multifunzionale e biocompatibile, composto da arginina e polietilenimmina innestato microparticelle di silicio poroso.

Abstract

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.

Introduction

I piccoli RNA interferenti (siRNA) sono molecole a doppio filamento di RNA che possono sopprimere l'espressione dei geni. Negli ultimi anni, siRNAs sono stati sviluppati come una nuova generazione di biofarmaci che mostrano potenziale terapeutico per uso futuro in applicazioni cliniche ^1-5. Tuttavia, il successo di una terapia siRNA resta una sfida considerevole, dovuta alla degradazione da nucleasi, scarsa captazione intracellulare, bassa efficienza di trasfezione e il rilascio inefficiente dal endosome / lisosomi ^5. Molti di questi ostacoli possono essere superati dallo sviluppo di piattaforme di distribuzione, che può sicuro ed efficiente fornire siRNA di tessuto malato. Rispetto ai vettori virali, le piattaforme non-virali offrono diversi vantaggi, come la sicurezza, a basso costo e facilità di sartoria. In particolare, le nanoparticelle cationici, come i polimeri e lipidi, sono dimostrate utili per la consegna siRNA ^3.

In precedenza, abbiamo sviluppato un dr discoidaleug sistema di consegna, definito il vettore multistadio (MSV). Tale piattaforma è basata su fasi sequenziali, in cui un veicolo viene rilasciato da un altro. La prima fase è un veicolo a base di microparticelle biodegradabili silicio poroso (psi), mentre il secondo stadio sono veicoli nanoparticelle caricate con farmaci o agenti di contrasto ^6,7. Le nanoparticelle, che sono incorporati nel materiale pSi, vengono gradualmente rilasciati come degrada il Si ^8. Un vantaggio di utilizzare particelle Si è che le caratteristiche morfologiche e di superficie possono essere facilmente personalizzati per realizzare biodistribuzione ottimale e rilascio del farmaco. Recentemente, l'uso efficace della piattaforma MSV per la consegna di siRNA liposomi al tessuto tumorale è stato mostrato in un modello di topo ovarico e cancro al seno ^{9, 10.}

In questo lavoro, abbiamo fabbricato un sistema di erogazione universale per siRNA in base ai principi della piattaforma MSV. L'efficacia di questo sistema di erogazione precedentemente us stata dimostrataing diverso siRNA molecole ^11. Il sistema è un silicio poroso (PCPS) carrier policatione-funzionalizzato, consistente pSi innestato con polietilenimmina (PEI) e arginina (Arg). PEI può aiutare a formare interazioni elettrostatiche con siRNA, mentre Arg e PSI può servire per ridurre la tossicità del PEI, come precedentemente demonstarted ^11. Inoltre, la presenza di PEI può aiutare nella captazione intracellulare e endosomal fuga, mentre le microparticelle psi consentono protezione siRNA e rilascio prolungato. Le particelle psi poco degradano in condizioni fisiologiche, ottenendo in tal modo la formazione di nanoparticelle Arg-PEI / siRNA (Figura 1), che hanno una morfologia distinta e una distribuzione granulometrica ristretta ^11. Per maggiori dettagli riguardanti la stabilità del sistema PCPS / siRNA, fare riferimento allo studio di Shen et al. ^11. Questa piattaforma PCPS differisce dal MSV convenzionale, dal momento che il secondo stadio nanoparticelle non sono inizialmente PRESEnt nel supporto, ma si formano nel tempo come carrier primo stadio degrada ^{11, 12.} L'efficienza siRNA carico efficienza, citotossicità e silenziamento genico del sistema PCPS è stata valutata in vitro. Efficienza di trasfezione è stata misurata utilizzando siRNA contro l'atassia telangiectasia mutato (ATM) oncogene, che è coinvolto nella riparazione del DNA ^10. In precedenza, la soppressione di ATM ha dimostrato di diminuire la crescita tumorale in un modello di cancro al seno ^10.

Protocol

1. Particle Preparazione PCPS Ossidare non funzionalizzati particelle di silicio poroso in una soluzione al 30% di perossido di idrogeno a 95 ° C per 2 ore. Aminate le particelle ossidate a 2% (3 amminopropil) trietossisilano soluzione in alcool isopropilico per 2 giorni a 65 ° C con delicata agitazione. Centrifugare la soluzione per 30 minuti a 18.800 xg e lavare le particelle due volte in alcool isopropilico e tre volte in etanolo, utilizzando breve sonicazione per sospendere il pellet. Lasciare…

Representative Results

Questo protocollo descrive l'uso di un sistema di erogazione non virale per sicuro ed efficiente siRNA trasfezione. I risultati SEM mostrano che le particelle PCPs sono di forma cilindrica e ha un diametro di 2,6 micron (Figura 2A). Le particelle vengono caricate positivamente con un potenziale zeta di circa 8,21 (Figura 2B), consentendo in tal modo elettrostatico vincolante con nucleotidi carica negativa. Immagini confocali di diversi strati di particelle PCPs dimostrano che il con…

Discussion

Questo protocollo descrive un metodo per il successo di consegna e trasfezione di siRNA in cellule. In particolare, la fornitura di siRNA è ottenuto utilizzando una piattaforma multifunzionale costituito da particelle PSI policatione-funzionalizzato. L'uso della terapia siRNA ha un grande potenziale, per esempio, il trattamento del cancro, come i vari oncogeni possono essere mirati con alta specificità. Pertanto, esiste una domanda per sviluppare veicoli di consegna siRNA, che può attenuare le sfide dell…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company/Institution	Catalog Number	Comments/Description
Polyethylenimine (PEI), branched	Sigma-Aldrich	408727	Average molecular weight ~25,000 Da
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006	Reagent grade, ≥98%
Boc-Asp-OH	Sigma-Aldrich	408-468	99%
(3-​Aminopropyl)​triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140	99%
Hydrogen peroxide solution	Sigma-Aldrich	216763	30 wt. % in H2O
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	339741	100.00%
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907	≥99.7%
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844	≥99.5%
N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC)	Sigma-Aldrich	03449	≥99%
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A7030-10G	Blocking agent
Ataxia-telangiectasia mutated siRNA	Sigma-Aldrich		Designed in-house
Tris Acetate-EDTA buffer	Sigma-Aldrich	T9650	For DNA agarose gel electrophoresis
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F2442
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P1379	Polyethylene glycol sorbitan monolaurate
2-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M6250	For Western blot
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L3771
Sodium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	71496	For making phosphate buffer
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	71640	For making phosphate buffer
Anti-Mouse IgG	Sigma-Aldrich	A4416	Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot
N-Hydroxysuccinimide (NHS)	Sigma-Aldrich	130672	98%
CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid	Greiner Bio-One	655182	96-well plate
10X Tris-Glycine Liquid	Li-Cor	928-40010	Transfer buffer for Western blot
Paraformaldehyde solution 4% in PBS	Santa Cruz	Sc-281692	Fixation of cells
CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS)	Promega	G5421	Proliferation assay
Phosphate buffered saline	Fisher Scientific	BP399-500	10 X Solution
Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.)	Fisher Scientific	MT-15-017-CM	Cell culture media, 1X solution
Triton X-100	Fisher Scientific	AC21568-2500	Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent
Cover glass	Fisher Scientific	12-530C
Methanol	Fisher Scientific	A412-1	For Western blot transfer buffer
Plastic Cuvettes	Fisher Scientific	14-377-010	For size measurements using Zetasizer Nano ZS
Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant	Fisher Scientific	14-754-34	Spray for removing RNAse contamination
Agarose	Fisher Scientific	BP165-25	Low melting point, for running RNA samples
ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI	Invitrogen	P36935	Antifade reagent with DAPI, nucelus detection
Alexa Fluor 488 Phalloidin	Invitrogen	A12379	Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin
SYBR Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102	Visualization of RNA
Negative Control siRNA	Qiagen	1022076	Control siRNA
AllStars Neg. siRNA AF 555	Qiagen	1027294	Fluorescent control siRNA
Cell scraper	Celltreat	229310
BioLite Multidishes and Microwell Plates	Thermo Scientific	130184	6-well plate
Pierce LDS Sample Loading Buffer (4X)	Thermo Scientific	84788	Sample loading buffer for Western blot
Pierce BCS Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23227	Protein quantification assay
Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100X)	Thermo Scientific	78430	Protease inhibitor cocktail, use at 1X
M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent	Thermo Scientific	78501	Protein extraction reagent
Sorvall Legend Micro 21R	Thermo Scientific	75002440	Centrifuge
Beta Actin Antibody	Thermo Scientific	MA1-91399	β-actin primary antibody (from mouse) for western blor
6X TriTrack DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R1161	DNA loading dye
Nuclease-Free Water	Life Technologies	AM9938
Non-Fat Dry Milk	Lab Scientific	M0841	For Western blot
2-well BD Falcon culture slides	BD Biosciences	354102	2-well culture slides
Amersham ECL Western blot detection reagent.	GE Healthcare Life Sciences	RPN2106	Western blot detection reagent
BA Membranes	GE Healthcare Life Sciences	10402096	Nitrocellulose membrane for Wester blot
ATM (D2E2) Rabbit mAb	Cell Signaling	2873S	ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling	7074	Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot
Folded capillary cells	Malvern	DTS 1061	For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS
MDA-MB-231 cell line	ATCC	HTB-26	Mammary Gland/Breast
12% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-rad	456-1043	For Western blot
Biorad PowerPac HC	Bio-rad	164-5052	Power supply for electrophoresis
10x Tris/Glycine/SDS Buffer	Bio-rad	161-0732	Running buffer for Western blot
Wide Mini-Sub Cell GT Cell	Bio-rad	170-4405	Electrophoresis equipment for DNA agarose gel
Mini-PROTEAN Tetra cell	Bio-rad	165-8000	Electrophoresis equipment for Western blot
ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software	Bio-rad	170-8265	Image acquisition and analysis software for gels and blots
4" (10cm) dia., 5x7mm diced Silicon Wafer	Ted Pella	16007	Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy
Thermomixer R	Eppendorf	22670107	Shaker
Isoton II diluent	Beckman Coulter	8546719	Isoton diluent
Multisizer 4 Coulter Counter	Beckman Coulter	A63076	Particle counting analyzer
Non-functionalized porous silicon particles	Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin		Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (hight), provided in isopropyl alcohol
Zetasizer Nano ZS	Malvern		Particle analyzer system for size and zeta potential
Scanning Electron Microscope	FEI		Particle size and shape
Atomic Force Microscope	Bruker		Particle size and shape
Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope	Olympus		Visualization of fixed and live cells