Poröses Silizium Mikropartikel für die Lieferung von siRNA-Therapeutika
Summary
Lieferung bleibt die größte Herausforderung für die therapeutische Anwendung der small interfering RNA (siRNA). Dieses Protokoll schließt die Verwendung eines multifunktionellen und biokompatibel siRNA Abgabeplattform, bestehend aus Arginin und Polyethylenimin gepfropft porösen Siliciummikropartikel.
Abstract
Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.
Introduction
Small interfering RNAs (siRNAs) sind doppelsträngige RNA-Moleküle, die die Expression von Genen unterdrücken kann. In den letzten Jahren haben siRNAs als eine neue Generation von biodrugs die therapeutisches Potential für die zukünftige Verwendung in klinischen Anwendungen 1-5 zeigen entwickelt. Die erfolgreiche Umsetzung der siRNA-Therapie bleibt jedoch eine große Herausforderung, durch Abbau durch Nukleasen, schlechte intrazelluläre Aufnahme, geringe Transfektionseffizienz und ineffizient Freisetzung aus dem Endosom / Lysosom 5. Viele dieser Hindernisse können durch die Entwicklung der Delivery-Plattformen, die sicher und effizient liefern kann siRNA auf erkranktes Gewebe zu überwinden. Im Vergleich zu Virusträgern nicht viralen Plattformen bieten mehrere Vorteile, wie Sicherheit, geringe Kosten und Einfachheit des Zuschneidens. Insbesondere kationischen Nanopartikeln, wie Polymere und Lipide, haben sich als nützlich für die siRNA-3 bewiesen.
Bisher haben wir eine scheibenförmige dr entwickeltug Liefersystem, der sogenannten mehrstufigen Vektor (MSV). Diese Plattform ist an aufeinanderfolgenden Stufen, in denen ein Fahrzeug, das von einem anderen veröffentlicht basiert. Die erste Stufe Fahrzeug ein Mikroteilchen aus biologisch abbaubaren porösen Silicium (psi) hergestellt, während die Fahrzeuge zweiten Stufe sind Nanopartikel mit Arzneimitteln oder Kontrastmittel 6,7 geladen. Die Nanopartikel, die im PSI Material eingebettet sind, werden nach und nach freigesetzt, wie die Si verschlechtert 8. Ein Vorteil der Verwendung von Si-Partikel ist, dass die Morphologie und Oberflächeneigenschaften können leicht angepasst, um eine optimale biologische Verteilung und Wirkstofffreisetzung erreicht werden. Kürzlich wurde die erfolgreiche Anwendung des MSV-Plattform für die Bereitstellung von siRNA Liposomen an Tumorgewebe in einer Eierstock- und Brustkrebs Mausmodell 9, 10 gezeigt.
In dieser Arbeit haben wir einen universellen Träger für siRNA, basierend auf den Prinzipien der MSV Plattform hergestellt. Die Wirksamkeit dieses Verabreichungssystem hat uns früher gezeigting unterschiedlichen siRNA-Moleküle 11. Das System ist ein Polykation-funktionalisierten porösen Silizium (PCPS) Träger, bestehend aus pSi mit Polyethylenimin (PEI) und Arginin (Arg) gepfropft. PEI kann bei der Bildung elektrostatische Wechselwirkungen mit siRNA unterstützen, während Arg und pSi kann dazu dienen, um die Toxizität von PEI zu reduzieren, wie zuvor demonstarted 11. Darüber hinaus kann die Anwesenheit von PEI in die intrazelluläre Aufnahme und endosomalen Flucht zu unterstützen, während die PSI-Mikropartikel ermöglichen siRNA Schutz und anhaltende Freisetzung. Die PSI-Partikel nach und nach unter physiologischen Bedingungen abgebaut werden, was zu der Bildung von Arg-PEI / siRNA-Nanopartikel (Abbildung 1), die einen ausgeprägten Morphologie und einer engen Größenverteilung 11 zu haben. Für detaillierte Angaben zur Stabilität der PCPS / siRNA-System finden Sie in der Studie beziehen von Shen et al. 11. Diese PCPS Plattform unterscheidet sich von der herkömmlichen MSV, da die Stufe Nanopartikel zweiten anfänglich nicht present in dem Träger, sondern werden über die Zeit gebildet wird wie das erste-Stufe-Träger abbaut 11, 12. Die siRNA Beladungseffizienz, Zytotoxizität und Gen-Silencing-Effizienz der PCPS System wurde in vitro untersucht. Transfektionseffizienz wurde mit siRNA gegen das Ataxia telangiectasia mutiert (ATM) Onkogen, das in der DNA-Reparatur beteiligt 10 gemessen. Früher war die Unterdrückung der ATM ist gezeigt worden, das Tumorwachstum in einer Brustkrebsmodell 10 zu verringern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur erfolgreichen und Transfektion von siRNA in Zellen. Insbesondere ist die Verabreichung von siRNA durch Verwendung eines multifunktionellen Plattform, bestehend aus Polykation-funktionalisierten pSi Partikel erreicht. Die Verwendung von siRNA-Therapie hat ein großes Potenzial, zum Beispiel Krebsbehandlung, da verschiedene Onkogene können mit hoher Spezifität ausgerichtet sein. Daher besteht ein Bedarf an siRNA Lieferfahrzeugen zu entwickeln, die die Herausforderun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge financial support from Houston Methodist Research Institute, the National Natural Science Foundation of China (Nos., 21231007 and 21121061), the Ministry of Education of China (Nos., 20100171110013 and 313058), the National Basic Research Program of China (973 Program No. 2014CB845604), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company/Institution | Catalog Number | Comments/Description |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10X Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10 X Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1X solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4X) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100X) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1X |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blor |
| 6X TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent. | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10cm) dia., 5x7mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (hight), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
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