Пористого кремния Микрочастицы для доставки миРНК терапии
Summary
Доставка остается основной проблемой для терапевтического реализации малых интерферирующих РНК (миРНК). Этот протокол предусматривает использование многофункционального и биосовместимого доставки миРНК платформы, состоящей из аргинина и микрочастиц пористого кремния полиэтиленимина привитые.
Abstract
Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.
Introduction
Малые интерферирующие РНК (киРНК) являются двухцепочечные молекулы РНК, которые могут подавлять экспрессию генов. В последние годы, siРНК, были разработаны в качестве нового поколения биопрепаратов, которые показывают терапевтический потенциал для будущего использования в клинической практике 1-5. Тем не менее, успешная реализация миРНК терапии остается значительной проблемой, из-за ухудшения нуклеазами, плохое внутриклеточного поглощения, низкой эффективности трансфекции и неэффективного освобождения из эндосом / лизосом 5. Многие из этих препятствий могут быть преодолены путем разработки платформ доставки, которые могут безопасно и эффективно доставки миРНК в пораженной ткани. По сравнению с вирусными перевозчиков, невирусные платформы обеспечивают ряд преимуществ, таких как безопасность, низкая стоимость и простота кроя. В частности, катионных наночастиц, таких как полимеры и липиды, которые оказались полезными для миРНК доставки 3.
Ранее мы разработали дисковидные DRмкг система доставки, называемый многоступенчатый вектор (MSV). Эта платформа основана на последовательных стадиях, в котором одно транспортное средство освобождается от другой. На первом этапе автомобиль микрочастиц изготовлены из биоразлагаемого пористого кремния (PSI), в то время как второй этап транспортные средства наночастицы, заполненные препаратов или контрастных агентов 6,7. Наночастицы, которые встроены в PSI материала, постепенно выпущен как деградирует Si 8. Преимущество использования Si частиц является то, что морфология и поверхностные характеристики могут быть легко адаптированы для достижения оптимального биораспределение и высвобождение лекарственного средства. В последнее время успешное использование MSV платформы для доставки миРНК липосом в опухолевую ткань была показана в яичника и рака молочной железы мыши модели 9, 10.
В этой работе мы изготовили универсальную систему доставки для миРНК на основе принципов в MSV платформы. Эффективность этой системы доставки ранее было показано намичисле различные Серна молекул 11. Система поликатион функционализованную пористый кремний (PCPS) перевозчик, состоящий из Пси привитого полиэтиленимином (PEI) и аргинина (Arg). PEI может помочь в формировании электростатических взаимодействий с миРНК, а Arg и PSI может служить, чтобы уменьшить токсичность PEI, как ранее организованы показы 11. Кроме того, присутствие PEI может помочь в внутриклеточного поглощения и эндосом побег, а микрочастицы пси включить защиту миРНК и замедленное высвобождение. Частицы PSI постепенно разрушаются в физиологических условиях, в результате чего в формировании Arg-PEI / миРНК наночастиц (рис 1), которые имеют ярко выраженный морфологию и узкое распределение по размерам 11. Для получения подробной информации об устойчивости системы PCPS / миРНК, пожалуйста, обратитесь к исследовании Shen и др., 11. Это PCPS платформа отличается от обычного MSV, начиная со второй наночастицы этап изначально не Пресент в носителе, но формируются с течением времени, как первой стадии носитель ухудшает 11, 12. миРНК загрузки эффективность, цитотоксичность и молчания генов эффективность системы лечащего врача была оценена в пробирке. Эффективность трансфекции измеряли с помощью миРНК против атаксии телеангиэктазии мутировал (ATM) онкоген, который участвует в репарации ДНК 10. Ранее подавление ATM, как было показано, чтобы уменьшить рост опухоли в модели рака молочной железы 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол описан способ успешной доставки и трансфекции в клетки миРНК. В частности, доставки миРНК достигается с помощью многофункционального платформу, состоящую из поликатиона функциональными частиц PSI. Использование миРНК терапии имеет большой потенциал, например, лечен…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge financial support from Houston Methodist Research Institute, the National Natural Science Foundation of China (Nos., 21231007 and 21121061), the Ministry of Education of China (Nos., 20100171110013 and 313058), the National Basic Research Program of China (973 Program No. 2014CB845604), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company/Institution | Catalog Number | Comments/Description |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10X Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10 X Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1X solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4X) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100X) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1X |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blor |
| 6X TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent. | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10cm) dia., 5x7mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (hight), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
- De Fougerolles, A., Vornlocher, H. P., Maraganore, J., Lieberman, J. Interfering with disease: a progress report on siRNA-based therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 443-453 (2007).
- Rolland, A. Gene medicines: the end of the beginning. Adv Drug Deliv Rev. 57 (5), 669-673 (2005).
- Oh, Y. K., Park, T. G. siRNA delivery systems for cancer treatment. Adv Drug Deliv Rev. 61 (10), 850-862 (2009).
- Mintzer, M. A., Simanek, E. E. Nonviral vectors for gene delivery. Chem Rev. 109 (2), 259-302 (2009).
- Whitehead, K. A., Langer, R., Anderson, D. G. Knocking down barriers: advances in siRNA delivery. Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 129-138 (2009).
- Decuzzi, P., et al. Size and shape effects in the biodistribution of intravascularly injected particles. J Control Release. 141 (3), 320-327 (2010).
- Decuzzi, P., Ferrari, M. Design maps for nanoparticles targeting the diseased microvasculature. Biomaterials. 29 (3), 377-384 (2008).
- Martinez, J. O., Evangelopoulos, M., Chiappini, C., Liu, X., Ferrari, M., Tasciotti, E. Degradation and biocompatibility of multistage nanovectors in physiological systems. J Biomed Mater Res A. 102 (10), 3540-3549 (2014).
- Shen, H., et al. Enhancing chemotherapy response with sustained EphA2 silencing using multistage vector delivery. Clin Cancer Res. 19 (7), 1806-1815 (2013).
- Xu, R., et al. Multistage vectored siRNA targeting ataxia-telangiectasia mutated for breast cancer therapy. Small. 9 (9-10), 1799-1808 .
- Shen, J., et al. High capacity nanoporous silicon carrier for systemic delivery of gene silencing therapeutics. ACS Nano. 7 (11), 9867-9880 (2013).
- Zhang, M., et al. Polycation-functionalized nanoporous silicon particles for gene silencing on breast cancer cells. Biomaterials. 35 (1), 423-431 (2014).
- Ozpolat, B., Sood, A. K., Lopez-Berestein, G. Nanomedicine based approaches for the delivery of siRNA in cancer. J Intern Med. 267 (1), 44-53 (2010).
- Philipp, A., Dehshahri, A., Wagner, A., E, Simple modifications of branched PEI lead to highly efficient siRNA carriers with low toxicity. Bioconjug Chem. 19 (7), 1448-1455 (2008).
- Hunter, A. C. Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity. Adv Drug Deliv Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).
- Andrews, P. M., Bates, S. B. Dose-dependent movement of cationic molecules across the glomerular wall. Anat Rec. 212 (3), 223-231 (1985).
- Ananta, J. S., et al. Geometrical confinement of gadolinium-based contrast agents in nanoporous particles enhances T1 contrast. Nat Nanotechnol. 5 (11), 815-821 (2010).
