Silicio Poroso micropartículas para la entrega de siRNA Terapéutica
Summary
Entrega sigue siendo el principal desafío para la aplicación terapéutica de pequeños ARN de interferencia (siRNA). Este protocolo implica el uso de una plataforma de entrega siRNA multifuncional y biocompatible, que consiste en arginina y polietilenimina injertada micropartículas de silicio poroso.
Abstract
Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the successful implementation of siRNA therapy requires the use of delivery platforms that can overcome the major challenges of siRNA delivery, such as enzymatic degradation, low intracellular uptake and lysosomal entrapment. Here, a protocol for the preparation and use of a biocompatible and effective siRNA delivery system is presented. This platform consists of polyethylenimine (PEI) and arginine (Arg)-grafted porous silicon microparticles, which can be loaded with siRNA by performing a simple mixing step. The silicon particles are gradually degraded over time, thereby triggering the formation of Arg-PEI/siRNA nanoparticles. This delivery vehicle provides a means for protecting and internalizing siRNA, without causing cytotoxicity. The major steps of polycation functionalization, particle characterization, and siRNA loading are outlined in detail. In addition, the procedures for determining particle uptake, cytotoxicity, and transfection efficacy are also described.
Introduction
Los pequeños RNAs de interferencia (siRNAs) son moléculas de ARN de doble cadena que pueden suprimir la expresión de genes. En los últimos años, siRNAs se han desarrollado como una nueva generación de biofármacos que muestran potencial terapéutico para uso futuro en aplicaciones clínicas 1-5. Sin embargo, la implementación exitosa de la terapia siRNA sigue siendo un reto considerable, debido a la degradación por nucleasas, mala absorción intracelular, la baja eficiencia de transfección y liberación ineficiente desde el endosoma / lisosoma 5. Muchos de estos obstáculos pueden ser superados por el desarrollo de plataformas de distribución, que puede entregar de forma segura y eficiente siRNA al tejido enfermo. En comparación con los portadores virales, las plataformas no virales proporcionan varias ventajas, como la seguridad, bajo costo y facilidad de adaptación. En particular, las nanopartículas catiónicos, tales como polímeros y lípidos, han demostrado su utilidad para la entrega siRNA 3.
Anteriormente, hemos desarrollado un dr discoidalug sistema de entrega, denominado el vector de múltiples etapas (MSV). Esta plataforma se basa en etapas secuenciales, en los que un vehículo se libera de otro. La primera etapa del vehículo es una micropartícula biodegradable hecha de silicio poroso (psi), mientras que los segundos vehículos etapa son nanopartículas cargadas con fármacos o agentes de contraste 6,7. Las nanopartículas, que están incrustados en el material de la ISP, se liberan gradualmente a medida que se degrada el Si 8. Una ventaja de usar partículas de Si es que las características de morfología y de la superficie pueden adaptarse fácilmente para lograr la biodistribución óptima y liberación del fármaco. Recientemente, el uso exitoso de la plataforma MSV para la entrega de liposomas siRNA a tejido tumoral se muestra en un modelo de ratón de ovario y cáncer de mama 9, 10.
En este trabajo, hemos fabricado un sistema de entrega universal para siRNA basado en los principios de la plataforma MSV. La eficacia de este sistema de entrega previamente nos ha demostradoing diferentes siRNA moléculas 11. El sistema es un portador de silicio poroso policatión-funcionalizado (PCPS), que consiste de la ISP injertado con polietilenimina (PEI) y arginina (Arg). PEI puede ayudar en la formación de interacciones electrostáticas con siRNA, mientras que Arg y la ISP pueden servir para reducir la toxicidad de PEI, como anteriormente demonstarted 11. Además, la presencia de PEI puede ayudar en la absorción intracelular y el escape endosomal, mientras que las micropartículas pSi permiten la protección siRNA y de liberación sostenida. Las partículas pSi degradan gradualmente en condiciones fisiológicas, lo que resulta en la formación de nanopartículas Arg-PEI / siRNA (Figura 1), que tienen una morfología distinta y una distribución de tamaño estrecha 11. Para obtener más información con respecto a la estabilidad del sistema PCPS / siRNA, por favor referirse al estudio de Shen et al. 11. Esta plataforma PCPS difiere del MSV convencional, ya que las nanopartículas segunda etapa no se prese inicialmentent en el portador, pero se forman con el tiempo como el portador de la primera etapa se degrada 11, 12. La eficiencia de carga siRNA eficiencia, la citotoxicidad y silenciamiento de los genes del sistema de PCPS se ha evaluado in vitro. La eficacia de transfección se midió usando siRNA contra de la ataxia telangiectasia mutada (ATM) oncogén, que está implicado en la reparación del ADN 10. Anteriormente, la supresión de la ATM se ha demostrado que disminuye el crecimiento del tumor en un modelo de cáncer de mama 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método para la entrega exitosa y transfección de ARNsi en las células. En particular, la entrega de siRNA se logra mediante el uso de una plataforma multifuncional que consiste de partículas pSi policatión-funcionalizado. El uso de la terapia de ARNip tiene un gran potencial, por ejemplo, el tratamiento del cáncer, ya que varios oncogenes pueden ser dirigidos con alta especificidad. Por lo tanto, existe una demanda para desarrollar vehículos de administración de ARNsi, que pue…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge financial support from Houston Methodist Research Institute, the National Natural Science Foundation of China (Nos., 21231007 and 21121061), the Ministry of Education of China (Nos., 20100171110013 and 313058), the National Basic Research Program of China (973 Program No. 2014CB845604), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company/Institution | Catalog Number | Comments/Description |
| Polyethylenimine (PEI), branched | Sigma-Aldrich | 408727 | Average molecular weight ~25,000 Da |
| L-Arginine | Sigma-Aldrich | A5006 | Reagent grade, ≥98% |
| Boc-Asp-OH | Sigma-Aldrich | 408-468 | 99% |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | 99% |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | 30 wt. % in H2O |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 339741 | 100.00% |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | ≥99.7% |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | ≥99.5% |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) | Sigma-Aldrich | 03449 | ≥99% |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A7030-10G | Blocking agent |
| Ataxia-telangiectasia mutated siRNA | Sigma-Aldrich | Designed in-house | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T9650 | For DNA agarose gel electrophoresis |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Polyethylene glycol sorbitan monolaurate |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M6250 | For Western blot |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | For making phosphate buffer |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640 | For making phosphate buffer |
| Anti-Mouse IgG | Sigma-Aldrich | A4416 | Secondary antibody (anti-mouse) for Western blot |
| N-Hydroxysuccinimide (NHS) | Sigma-Aldrich | 130672 | 98% |
| CELLSTAR 96W Microplate Tissue Culture Treated Clear w/ Lid | Greiner Bio-One | 655182 | 96-well plate |
| 10X Tris-Glycine Liquid | Li-Cor | 928-40010 | Transfer buffer for Western blot |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | Santa Cruz | Sc-281692 | Fixation of cells |
| CellTiter 96 AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (MTS) | Promega | G5421 | Proliferation assay |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP399-500 | 10 X Solution |
| Corning cellgro Dulbecco's Modification of Eagle's (Mod.) | Fisher Scientific | MT-15-017-CM | Cell culture media, 1X solution |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Octyl phenol ethoxylate, permeabilization agent |
| Cover glass | Fisher Scientific | 12-530C | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-1 | For Western blot transfer buffer |
| Plastic Cuvettes | Fisher Scientific | 14-377-010 | For size measurements using Zetasizer Nano ZS |
| Molecular BioProducts RNase AWAY Surface Decontaminant | Fisher Scientific | 14-754-34 | Spray for removing RNAse contamination |
| Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | Low melting point, for running RNA samples |
| ProLong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Antifade reagent with DAPI, nucelus detection |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | Dissolve 300 units in 1.5 ml methanol, detection of filamentous actin |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | Visualization of RNA |
| Negative Control siRNA | Qiagen | 1022076 | Control siRNA |
| AllStars Neg. siRNA AF 555 | Qiagen | 1027294 | Fluorescent control siRNA |
| Cell scraper | Celltreat | 229310 | |
| BioLite Multidishes and Microwell Plates | Thermo Scientific | 130184 | 6-well plate |
| Pierce LDS Sample Loading Buffer (4X) | Thermo Scientific | 84788 | Sample loading buffer for Western blot |
| Pierce BCS Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23227 | Protein quantification assay |
| Halt Protease Inhibitor Single-Use Cocktails (100X) | Thermo Scientific | 78430 | Protease inhibitor cocktail, use at 1X |
| M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent | Thermo Scientific | 78501 | Protein extraction reagent |
| Sorvall Legend Micro 21R | Thermo Scientific | 75002440 | Centrifuge |
| Beta Actin Antibody | Thermo Scientific | MA1-91399 | β-actin primary antibody (from mouse) for western blor |
| 6X TriTrack DNA Loading Dye | Thermo Scientific | R1161 | DNA loading dye |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| Non-Fat Dry Milk | Lab Scientific | M0841 | For Western blot |
| 2-well BD Falcon culture slides | BD Biosciences | 354102 | 2-well culture slides |
| Amersham ECL Western blot detection reagent. | GE Healthcare Life Sciences | RPN2106 | Western blot detection reagent |
| BA Membranes | GE Healthcare Life Sciences | 10402096 | Nitrocellulose membrane for Wester blot |
| ATM (D2E2) Rabbit mAb | Cell Signaling | 2873S | ATM primary antibody (from rabbit) for Western blot |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody (anti-rabbit) for Western blot |
| Folded capillary cells | Malvern | DTS 1061 | For zeta potentail measurements using Zetasizer Nano ZS |
| MDA-MB-231 cell line | ATCC | HTB-26 | Mammary Gland/Breast |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Gel | Bio-rad | 456-1043 | For Western blot |
| Biorad PowerPac HC | Bio-rad | 164-5052 | Power supply for electrophoresis |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-rad | 161-0732 | Running buffer for Western blot |
| Wide Mini-Sub Cell GT Cell | Bio-rad | 170-4405 | Electrophoresis equipment for DNA agarose gel |
| Mini-PROTEAN Tetra cell | Bio-rad | 165-8000 | Electrophoresis equipment for Western blot |
| ChemiDoc XRS+ System with Image Lab Software | Bio-rad | 170-8265 | Image acquisition and analysis software for gels and blots |
| 4" (10cm) dia., 5x7mm diced Silicon Wafer | Ted Pella | 16007 | Silicon waferfor scanning electron microscopy and atomic force microscopy |
| Thermomixer R | Eppendorf | 22670107 | Shaker |
| Isoton II diluent | Beckman Coulter | 8546719 | Isoton diluent |
| Multisizer 4 Coulter Counter | Beckman Coulter | A63076 | Particle counting analyzer |
| Non-functionalized porous silicon particles | Microelectronics Research Center, University of Texas at Austin | Dicoidal shape. 2.6 μm (diameter) x 0.7 μm (hight), provided in isopropyl alcohol | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | Particle analyzer system for size and zeta potential | |
| Scanning Electron Microscope | FEI | Particle size and shape | |
| Atomic Force Microscope | Bruker | Particle size and shape | |
| Fluo ViewTM 1000 Confocal Microscope | Olympus | Visualization of fixed and live cells |
References
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