La jonction neuromusculaire: Synapse mesurer la taille, fragmentation et les changements dans Synaptic Protein densité en utilisant microscopie de fluorescence confocale
Summary
The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.
Abstract
La jonction neuromusculaire (JNM) est le grand, le relais synapse cholinergique par lequel les neurones moteurs de mammifères contrôlent contraction des muscles volontaires. Les changements structurels au NMJ peuvent entraîner l'échec de la neurotransmission, résultant dans la faiblesse, l'atrophie et même la mort de la fibre musculaire. De nombreuses études ont étudié comment les modifications génétiques ou de maladies peuvent modifier la structure de la jonction neuromusculaire de la souris. Malheureusement, il peut être difficile de comparer directement les résultats de ces études parce qu'ils travaillent souvent différents paramètres et les méthodes analytiques. Trois protocoles sont décrits ici. La première utilise la projection d'intensité maximale images confocales pour mesurer la surface des récepteurs de l'acétylcholine (RACh) riche domaines membranaires post-synaptiques à la plaque d'extrémité et la surface de la vésicule synaptique coloration dans la terminaison nerveuse présynaptique sus-jacente. Le deuxième protocole compare les intensités relatives des immunocoloration des protéines synaptiques dans la membrane post-synaptique. La troisième protocole utilise Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour détecter les changements dans l'emballage d'AChR post-synaptiques à la plaque d'extrémité. Les protocoles ont été développé et affiné au cours d'une série d'études. Les facteurs qui influencent la qualité et la cohérence des résultats sont discutés et données normatives sont fournis pour NMJs chez les jeunes souris adultes en bonne santé.
Introduction
La jonction neuromusculaire (JNM) est la synapse de relais essentiel qui médie la communication entre le système nerveux et le muscle squelettique. Il est nécessaire pour tout mouvement volontaire. La microscopie à fluorescence a longtemps été utilisé pour étudier les effets des transgènes sur la souris NMJ 1-3 ou de comparer les effets de l'âge, l'alimentation, l'exercice et la maladie sur NMJs de rongeurs 4-11. Ces études nous ont beaucoup appris sur la physiologie et la physiopathologie de la NMJ, mais les divers paramètres déclarés (par exemple, la zone AChR, zone flasque, longueur du périmètre, indices de fragmentation) font qu'il est souvent difficile de comparer les résultats de ces études. Il ya une attente de plus en plus pour les chercheurs précliniques pour pouvoir démontrer la reproductibilité, en particulier dans les études avec des modèles de rongeurs de la maladie 12. Les protocoles décrits ici ont été affinées par une série d'études qui a enquêté ch développement, physiologique et physiopathologiqueAnges à l'NMJ. Ces études nécessitent la mesure de la zone de spécialisations synaptiques à la plaque motrice de la souris et de la densité relative de l'emballage de protéines synaptiques dans les spécialisations post-synaptiques 13-15.
L'utilité de ces méthodes est illustrée par des études récentes dans un modèle de souris de l'anti-MuSK myasthénie. Injections quotidiennes d'IgG de myasthénie anti-MuSK positif gravis patients dans des souris adultes causés à devenir faible dans les deux semaines 16. Confocale images maximale de projection de sections musculaires qui ont été doublement marquée pour la synaptophysine (en nerveuses terminaux) et post-synaptiques AChR révélé un déclin progressif dans le domaine de AChR coloration que le principal changement. Surtout le taux de déclin était suffisante pour expliquer les baisses comparables dans l'amplitude des potentiels synaptiques, l'échec de la transmission synaptique et une faiblesse musculaire 17,18. Qualitativement résultats similaires ont été rapportés par d'autres groupes de recherche10,19. Les mêmes méthodes de mesure NMJ ont depuis été utilisés pour évaluer l'impact de trois médicaments pour le traitement anti-MuSK myasthénie grave dans ce modèle de souris 20,21.
Vieillissement sédentaire peut conduire à la perte de connexions neuromusculaires. Les protocoles décrits ici ont révélé une baisse liée à l'âge dans le domaine de terminaison nerveuse synaptophysine à plaques motrices que les souris progressent dans la vieillesse. Les mêmes méthodes ont révélé que l'exercice volontaire pourrait largement éviter la réduction de nerf présynaptique zone de la borne 22, en accord avec les travaux antérieurs par d'autres groupes 4. Perte de connexions neuromusculaires se produit également dans le modèle de la souris SOD1G93A de la sclérose latérale amyotrophique 9,23.
Les études mentionnées ci-dessus démontrent que une variété de conditions de santé peut conduire à des réductions dans le domaine de spécialisation soit pré- ou post-synaptiques au NMJ. Cela peut entraîner dans l'amusement synaptique altéréection ou peut annoncer une perte complète de la connexion neuromusculaire. Trois protocoles sont décrits qui permettent la quantification de la superficie et de la densité de spécialisations synaptiques. Le but du premier protocole est de fournir une mesure pratique et reproductible des zones de pré et post-synaptiques spécialisations et leur alignement au NMJs mammifères, en utilisant la microscopie de fluorescence. Images bidimensionnelles projection confocale maximales et analyse d'image avec les NIH ImageJ est utilisé pour détecter des changements dans le domaine de la coloration (synaptophysine des vésicules synaptiques), AChR post-synaptiques et de la zone de chevauchement synaptique. Paramètres d'imagerie confocale (gain et décalage de niveau) sont optimisés pour chaque NMJ de façon à maximiser l'information visuelle utilisée pour discerner le domaine de spécialisation synaptique. Insuffisance neuromusculaire peut également résulter de changements dans la densité post-synaptique du CCRS et / ou d'autres protéines synaptiques. Le deuxième protocole peut être appliqué à détecter les changements dans la densité relative de ces protéines postsynaptiquesque le musc, rapsyne, dystroglycane, phosphorylée kinase Src et phosphorylée AChR 18,21.
Dans la myasthénie grave, une densité réduite de AChR dans la membrane post-synaptique est la cause immédiate de l'insuffisance synaptique et une faiblesse musculaire. Le troisième protocole décrit une méthode Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) pour évaluer les changements dans la proximité de AChR adjacentes dans des membranes post-synaptiques 14,15. Cette méthode détecte transfert d'énergie entre AChR voisins marqués par fluorescence-α-bungarotoxine (BGT). FRET se produit uniquement lorsque les sondes fluorescentes donneur et accepteur sont à moins de 10 nm de l'autre. Cela peut révéler (microscopiques) des changements dans l'étanchéité de AChR emballage qui peuvent être directement liés à l'amplitude des potentiels synaptiques.
Ces trois protocoles, raffinés au cours de la dernière décennie, fournissent des mesures complémentaires d'intégrité NMJ d'une manière cohérente et reproductible. Utilisation de protocoles normalisés unend paramètres devraient faciliter la comparaison des effets des gènes et des interventions environnementales sur le NMJ mammifères.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles décrits ici nous ont permis de mesurer de manière fiable et quantifier les changements dans les propriétés de la NMJ toute une gamme de conditions, notamment le vieillissement et les maladies états normaux. Les méthodes décrites pour en Face images NMJ permettront aux chercheurs de comparer le domaine des spécialisations pré- et post-synaptiques et la région synaptique de chevauchement / alignement. Pour comparer l'intensité relative des protéines pré- et post-synaptiques le deuxième pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Health and Medical Research Council [570930]. Imaging was carried out at the Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Former members of the lab, whose work is cited, are thanked for their contributions to developing these methods.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Scanning confocal microscope | Leica | DM IRE2 with TCS SP2 system | Most scanning confocal microscopes should be suitable. |
| Zeiss | LSM 510 Meta | ||
| Leica | SPE-II | ||
| Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) | Life technologies | B35451 | Used for labelling AChRs |
| Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece |
| rabbit anti-synaptophysin | Life technologies | 18-0130 | Different batches of primary antibody differ in effective working dilution |
| FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Monoclonal antibody conjugated to FITC |
| FITC-donkey anti-rabbit IgG | Jackson | 711-095-152 | Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch |
| Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Cryostat embedding matrix for freezing muscles |
| DABCO | Sigma | 10981 | Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors |
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