La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia
Summary
The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.
Abstract
La unión neuromuscular (UNM) es la sinapsis relé grande, colinérgica a través del cual las neuronas motoras de mamíferos controlan la contracción muscular voluntaria. Los cambios estructurales en la UNM pueden resultar en el fracaso de la neurotransmisión, resultando en debilidad, atrofia e incluso la muerte de la fibra muscular. Muchos estudios han investigado cómo las modificaciones genéticas o enfermedades pueden alterar la estructura de la UNM ratón. Desafortunadamente, puede ser difícil comparar directamente los resultados de estos estudios ya que a menudo emplean diferentes parámetros y métodos analíticos. Tres protocolos se describen aquí. El primero utiliza la proyección de intensidad máxima imágenes confocal para medir el área de receptor de acetilcolina (AChR) ricos en dominios de la membrana postsináptica en la placa terminal y el área de tinción de las vesículas sinápticas en la terminal nerviosa presináptica suprayacente. El segundo protocolo se comparan las intensidades relativas de inmunotinción para proteínas sinápticas en la membrana postsináptica. La tercera protocol utiliza la transferencia de energía de fluorescencia por resonancia (FRET) para detectar cambios en el embalaje de AChR postsinápticos en la placa terminal. Los protocolos se han desarrollado y perfeccionado a lo largo de una serie de estudios. Los factores que influyen en la calidad y la consistencia de los resultados se discuten y datos normativos se proporcionan para NMJs en ratones adultos jóvenes sanos.
Introduction
La unión neuromuscular (NMJ) es la sinapsis relé crítico que media la comunicación entre el sistema nervioso y músculo esquelético. Se requiere para todo el movimiento voluntario. La microscopía de fluorescencia se ha utilizado para estudiar los efectos de los transgenes en el ratón NMJ 1-3 o para comparar los efectos de la edad, la dieta, el ejercicio y la enfermedad en roedores NMJs 4-11. Tales estudios han enseñado mucho acerca de la fisiología y la fisiopatología de la UNM, pero los diversos parámetros informado (por ejemplo, área AChR, área de placa terminal, longitud del perímetro, los índices de fragmentación) a menudo hacen que sea difícil comparar los resultados de estos estudios. Hay una expectativa creciente de investigadores pre-clínicos para ser capaces de demostrar la reproducibilidad, en particular en estudios con modelos de roedores de enfermedad 12. Los protocolos descritos aquí fueron refinados a través de una serie de estudios que investigaron ch desarrollo, fisiológico y fisiopatológicoanges de la UNM. Tales estudios requieren la medición de la zona de especializaciones sinápticas en la placa motora terminal del ratón y la densidad relativa de embalaje de las proteínas sinápticas dentro de especializaciones postsinápticos 13-15.
La utilidad de estos métodos se ilustra por estudios recientes en un modelo de ratón de anti-MuSK miastenia gravis. Las inyecciones diarias de IgG de miastenia anti-MuSK positivos gravis pacientes en ratones adultos causó que se vuelven débiles dentro de 2 semanas 16. Imágenes de máxima proyección confocal de secciones musculares que fueron etiquetados doble para sinaptofisina (en terminales nerviosas) y AChR postsinápticos revelaron una disminución progresiva en el área de tinción AChR como el principal cambio. Es importante destacar que la tasa de disminución fue suficiente para explicar la disminución comparables en la amplitud de los potenciales sinápticos, fracaso de la transmisión sináptica y debilidad muscular 17,18. Cualitativamente hallazgos similares fueron reportados por otros grupos de investigación10,19. Los mismos métodos de medición NMJ ya se han utilizado para evaluar el impacto de tres fármacos para el tratamiento de la miastenia gravis anti-MuSK en este modelo de ratón 20,21.
Envejecimiento sedentario puede llevar a la pérdida de las conexiones neuromusculares. Los protocolos descritos aquí han revelado una disminución asociada a la edad en la zona de sinaptofisina terminación nerviosa en placas motoras como ratones progresan en la vejez. Los mismos métodos revelaron que el ejercicio voluntario podría evitar en gran medida la reducción de la zona de la terminal nerviosa presináptica 22, en consonancia con el trabajo previo de otros grupos 4. La pérdida de las conexiones neuromusculares también se produce en el modelo de ratón SOD1G93A de la esclerosis lateral amiotrófica 9,23.
Los estudios mencionados anteriormente demuestran que una variedad de condiciones de salud puede conducir a la reducción de la superficie de cualquiera de las especialidades pre o post-sináptica en la UNM. Esto puede producir problemas para la diversión sinápticacción o puede anunciar la pérdida completa de la conexión neuromuscular. Tres protocolos se describen que permiten la cuantificación de la zona y la densidad de especializaciones sinápticas. El propósito de la primera protocolo es proporcionar una medida práctica y reproducible de las áreas de pre y post-sinápticas especializaciones y su alineación en NMJs de mamíferos, usando microscopía de fluorescencia. Confocal de imágenes de proyección máximo de dos dimensiones y análisis de imagen con NIH ImageJ se utiliza para detectar cambios en el área de tinción sinaptofisina (vesículas sinápticas), AChR postsinápticos y área de superposición sináptica. Parámetros confocal de imágenes (ganancia y nivel de compensación) se han optimizado para cada NMJ a fin de maximizar la información visual utilizado para discernir el área de especialización sináptica. Insuficiencia neuromuscular también puede resultar de los cambios en la densidad de AChR postsináptica y / o otras proteínas sinápticas. El segundo protocolo se puede aplicar para detectar cambios en la densidad relativa de las proteínas postsinápticos talescomo el almizcle, RapSyn, distroglicano, fosforilada quinasa Src y fosforilada AChR 18,21.
En la miastenia gravis, una densidad reducida de AChR dentro de la membrana postsináptica es la causa inmediata del fracaso sináptica y la debilidad muscular. El tercer protocolo describe un método de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para evaluar los cambios en la proximidad de AChR adyacentes dentro de las membranas postsinápticas 14,15. Este método detecta la transferencia de energía entre AChR vecinos marcados con fluorescente-α-bungarotoxina (BGT). FRET se produce sólo cuando el donante y aceptor de sondas fluorescentes son de menos de 10 nm de distancia. Esto puede revelar cambios (submicroscópicas) en la estanqueidad de embalaje AChR que pueden relacionarse directamente a la amplitud de los potenciales sinápticos.
Estos tres protocolos, refinados durante la última década, proporcionan medidas complementarias de integridad NMJ de una manera consistente y reproducible. El uso de protocolos estandarizados unaparámetros nd deben facilitar la comparación de los efectos de los genes y las intervenciones ambientales sobre los mamíferos NMJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los protocolos descritos aquí nos han permitido medir y cuantificar los cambios en las propiedades de la UNM en toda una serie de condiciones, incluyendo los estados normales de envejecimiento y la enfermedad. Los métodos descritos para en face imágenes NMJ permitirán a los investigadores comparan el área de especialidades pre y postsinápticos y el área de superposición sináptica / alineación. Para comparar la intensidad relativa de las proteínas pre y postsinápticos el segundo protocolo, que utiliza seccion…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Health and Medical Research Council [570930]. Imaging was carried out at the Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Former members of the lab, whose work is cited, are thanked for their contributions to developing these methods.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Scanning confocal microscope | Leica | DM IRE2 with TCS SP2 system | Most scanning confocal microscopes should be suitable. |
| Zeiss | LSM 510 Meta | ||
| Leica | SPE-II | ||
| Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) | Life technologies | B35451 | Used for labelling AChRs |
| Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece |
| rabbit anti-synaptophysin | Life technologies | 18-0130 | Different batches of primary antibody differ in effective working dilution |
| FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Monoclonal antibody conjugated to FITC |
| FITC-donkey anti-rabbit IgG | Jackson | 711-095-152 | Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch |
| Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Cryostat embedding matrix for freezing muscles |
| DABCO | Sigma | 10981 | Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors |
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