Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.
In this demonstration, spheroids formed from the β-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.
כדי לייצר מספר רב של תאים אנושיים קיימא והפונקציונליים להשתלה, הסדרת תנאי התרבות הכרחית. דלדול של חומרי הזנה, יחד עם הצטברות הפסולת המטבולית הם התורמים העיקריים לשינויים מהזדקנות מטבולית לפגוע באיכות התא המוצר 1 – 3. הליך זה מדגים שיטה בתאי יונקים תרבות spheroids באמצעות bioreactor עוררה בשילוב עם מערכת האכלה שיעור זלוף המתואם להסדיר גלוקוז בטווח הפיזיולוגי 4 לכל אורכו של התרבות. לצורך המחקרים הללו, לטווח הפיזיולוגי הוגדר בין 100 ל -200 מ"ג / ד"ל. אותן שיטות שניתן להשתמש בהם כדי להסדיר מזינים אחרים ופסולת מטבולית כגון חומצת חלב.
תרבויות סטטי בנפחים קטנים (1 – 30 מיליליטר) משמשות בדרך כלל את הגדרת המעבדה לשמור ולבדל שורות תאים עבור experimeלמטרות פתיחות opening סגירות closures. passaging Cell מתבצע עם שינויים בינוניים מלאים לפי צורך במרווחים קבועים. רוב "קונבנציונלי" מדיום התרבות יש ריכוז גלוקוז גבוה (450 מ"ג / ד"ל DMEM שימוש במחקרים אלה) כדי לאפשר את השינויים בינוניים תכופים פחות, מבלי להסתכן ביצירת מגבלות מזינות. עם זאת, שיטה-האכלה תצווה זה עדיין דורשת מניפולציה תכופה, מציגה השתנות סביבת התא, ומגבירה את הסיכון לזיהום 5 – 9. Bioreactors השעיה עוררה (SSB) לספק ערבוב טוב יותר וירידת טיפול 3,10 – 20, אבל כמו תרבויות סטטי מצריך שינוי בינוני ידני שתורמים תנודות שעלולות להזיק ברמות המוצר מזינות ופסולת. האכלה זלוף של תרבויות SSB מפחיתה בעיות אלו על ידי עירוי מתמשך והסרה של מדיום, אבל שינויים גדולים ברמות מזינות עקב צמיחת תאים להישאר בעיה. השימוש של ra האכלה מתואםte מחישובים של שימוש מזין על בסיס דרישות תא מוערך יכול לספק את סביבת תאי יציבות נדרשת לייעל כדאיויות תא ומתפקד 21 – 24.
ישנו גוף גדול של ספרות המתאר שיטות תרבויות SSB להרחבה של בתאי יונקים במיוחד עבור התרבות והרחבת תאים פלוריפוטנטיים 25 – 32, עם אחרים התמקדו איון (בטא) תאים 17,33,34, או ייצור של מוצרים ביולוגיים 24, 35 – 38. רבים של סוגי התאים הנחקרים אלה עשויים להיות מבוגרים בתרבויות אליפטית, ונהלים ספציפיים עבור סוג התא בשימוש צריכים להיות מותאמים לפני יישום מערכת האכלה רציפה. בהפגנה זו, שיטת האכלת זלוף שמשה להרחיב קו תאי בטא גדל כמו spheroids בתוך bioreactor בחש 39 – 43. השיטה המתוארת במסמך זה מספקיישום פשוט של האכלת התאמות שיעור המבוססות על מדידות גלוקוז off-line כדי להשיג תנאי תרבות ממוקדות. התאמת קצב ההזנה בשיטה זו כדי לשמור על רמת גלוקוז פיזיולוגית מוצגת לתשואות תא עליות. בתאי יונקים מותנים מזין, גלוקוז מפתח, לייצור אנרגיה, ולכן שימוש שורות התאים מהווה מודל עבור בתאי יונקים בתרבית רבים 44. בנוסף, קו זה מדגים את המורכבות גדולות יותר של תאי בטא, אשר רגישים לרמות גבוהות הכרוניות של גלוקוז 45. לצורך המחקר, תאי β-TC6 הורשו יוצרים spheroids בתרבות כדי להיות קרובים ככל האפשר הגודל הממוצע של איי לנגרהנס in vivo. מערכת bioreactor זלוף 17 – 19,21,46 עם שיעור להאכיל המותאם לגלוקוז צריכה, הביאה שמירת מצבים פיסיולוגיים תשואות תא גבוהות ללא שינויים כדאיים.
יצירת מוצרי תאים יונקים לייצור חומרים ביולוגיים עבור טיפולים בתאים דורשת ההתרבות וניטור בתאי יונקים בקנה מידה גדולה 55 – 58. יתר על כן, יישומים אלה מחייבים שורה של תנאי התרבות מוגדרות ומאומתים. כל שעליך לעשות הוא להגדיל את הנפח של תאים באמצעות טכנולוג?…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Michael Garwood and Sam Stein for their helpful comments, and Kristen M. Maynard for assistance with manuscript preparation.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number / Link | Comments/Description |
BTC-6 Cells | ATCC, Manassas, VA | CRL-11506 | Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type) |
DPBS No CA, No Mg | Invitrogen, Carlsbad, CA | 14190-144 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144 |
Dulbecco's Modified Eagles Medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | See below for product numbers | |
DMEM High Glucose (500mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11965-092 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092 |
DMEM Low Glucose (100mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11885-084 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate) |
L-gultamine | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25030081 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product |
Sodium Pyruvate | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11360070 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product |
Heat Inactivated Porcine Serum | Gibco – Life Technologies | 10082147 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147 |
Trypsin-EDTA | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25200056 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product |
T-150 Tissue Culture Treated Flasks | Corning, Corning, NY | 430825 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) &categoryname= |
NuAire Cell culture incubator | Princeton, MN | US Autoflow , Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used | |
Centrifuge | Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used) | ||
Refrigerator | Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies) | ||
1L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-1L | Any vendor could be used http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) &categoryname= |
2L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-2L | Any vendor could be used |
250 ml stirred bioreactors | Corning, Corning, NY | 4500-250 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) &categoryname= |
Stir Plate | Fisher Scientific | 11-496-104A | Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor |
Tissue Culture Dishes 100mm Diameter | Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) | 1256598 | Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci) |
FALCON 50 ml Conical Tubes | Falcon, San Jose, CA | 1256598 | Any vendor could be used |
Delran Plastic Used for Custom Parts | McMaster Carr | Various | Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine, http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac |
Stainless Steel Pipe for custom lids | McMaster Carr | Various | Any vendor could be used, http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91 |
Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding | Custom made | Not aware of any vendors producing a similar product | |
Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding | Custom made | Some vendors (eg. Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below | |
Masterflex Digital Peristaltic Pump | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-77919-25 | Any precision peristaltic pump could be used, http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25 |
PVDF Tubing Connectors (various) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | see link | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889 |
Pharmed BPT Tubing L/S 16 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-16 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16 |
Pharmed BPT Tubing L/S 14 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-14 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14 |
Pharmed BPT Tubing L/S 13 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-13 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-13 |
Millipore Millex GP PES membrane 0.22ul sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) | Fisher Scientific | SLGP033RS | Any vendor could be used |
25ml Graduated Pipette | Fisher Scientific | 13-678-11 | Any vendor could be used, and various sizes may be used |
Pipetter | Fisher Scientific | 13-681-15E | Any vendor, or similar product could be used |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Any vendor, or similar product could be used |
Trypan Blue | Gibco – Life Technologies | 15250-061 | Any vendor, or similar product could be used, https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061 |
Inverted Light Microscope | Leica | Any vendor, or similar product could be used | |
One Touch Ultra Blood Glucose Meter | Fisher Scientific | 22-029-293 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |
One Touch Ultra-Strips | Fisher Scientific | 22-029-292 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |