신경 세포의 3 차원 이미징 및 분석 감염<em> 생체</em>와<em> 톡소 포자충</em
Summary
이 프로토콜을 사용하여, 우리는 시각화 및 encysting 기생충 감염된 신경 세포 사이의 공간 관계의 분석을 가능하게 기생충 톡소 포자충, 감염된 마우스의 이미지를 160 μm의 두께 뇌 부분에 수 있었다.
Abstract
톡소 포자충은 인간과 설치류를 포함한 광범위한 호스트 범위와 의무적 인, 세포 내 기생충이다. 모두 인간과 설치류에서, 톡소 플라스마는 뇌의 평생 지속적인 감염을 설정합니다. 이 뇌 감염이 태아 또는 뇌의 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS) 환자에 대한이 편애 및 지속성 등의 면역 개인, 대부분의 면역 사람들 무증상이지만 파괴적인 신경 학적 질환으로 이어질 수 있습니다. 따라서, 뇌 – 톡소 상호 작용에 의해 생성 톡소 질병 증상에 중요하다, 그러나 우리는 중추 신경계 (CNS) 및 기생충 세포 간의 세포 또는 분자 상호 작용의 이해가 작은 것은 분명하다. CNS의 마우스 모델에서이 신경 기생충가 지속되는 세포 인 30 년 이상 알려져있다 톡소 플라스마 증,하지만 약간의 정보는 약 사용 가능신경 세포의 일부는 일반적으로 (소마, 수상 돌기, 축색 돌기를) 감염이 세포 관계는 긴장 사이에서 변경하는 경우. 부분에서는 부족은 촬상의 어려움과 이차 전체 감염된 동물로부터 신경 세포를 시각화한다. 이러한 이미지는 통상적으로 직렬 절편 및 전자 현미경 또는 면역 염색 후 공 초점 현미경에 의해 촬상 조직 봉합을 필요로한다. 몇 가지 기술을 조합하여, 여기에 기재된 방법은 면역의 필요없이 입체 시각화 및 개별 만성적 감염 뉴런의 분석을 가능하게 식별하고 낭종이 포함 된 이미지 전체 셀에 두꺼운 부분의 사용 (160 μm의) 사용, 전자 현미경 , 또는 직렬 절편과 바느질. 이 기술을 사용하여, 우리는 기생충 감염 및 신경 세포 사이의 관계를 이해하기 시작할 수있다.
Introduction
이 방법의 전체 목표는 고해상도, 의무적 인 세포 내 기생충 톡소 포자충에 감염 개별 뉴런의 3 차원 영상을 얻는 것이다.
톡소 때문에 종종 인간과 설치류를 포함 대형 중간 숙주 범위의 가장 성공적인 기생충 중 하나를 간주됩니다. 인간과 쥐 모두에서, 오염 된 음식이나 물을 섭취를 통해 급성 감염 후, 톡소 플라스마는 양식을 그 느린 복제로의 빠른 복제 양식 (tachyzoite)에서 변환 encysting에 의해 중추 신경계의 지속적인 감염을 일으킬 수있다 (bradyzoite ). 면역 개인,이 잠재 중추 신경계 감염은 비교적 증상이없는 것으로 생각되지만, 에이즈 환자 또는 이식 환자와 같은 면역 개인에, 기생충의 재발은 치명적인 toxoplasmic 뇌염 1,2로 이어질 수 있습니다. 또한, 최근의 연구 하메커니즘은 알 수없는 남아 있지만 톡소 플라스마와 잠재 감염, 설치류 3,4의 행동 변화로 이어질 수있는 것으로 나타했습니다.
놀랍게도, CNS- 톡소 상호 작용의 중요성을 강조하는 이들 데이터에도 불구하고, 비교적 작은, 특히 세포 및 분자 수준에서,이 관계에 대해 공지되어있다. 뇌 기생충 상호 작용의도 간단한 측면을 연구하는 기능은 technologic의 제한에 의해 부분적으로 방해하고있다. 예를 들어, 대부분의 작업은 뉴런 낭종 전자 현미경 (EM) 5,6- 수행 한 지속되는 셀임을 나타내는. EM은 높은 해상도를 제공하지만, 그것은 시간이 소요, 노동 집약적, 비싸다. 면역 형광 (IF) 분석은 최근 EM (7)에 의해 수행 된 작업을 확인하기 위해 공 초점 현미경과 함께 사용되어왔다. 분석은 수행 할 기술적으로 쉽고 상대적으로 저렴하지만, 언더에 이러한 기술을 사용하는 경우TAND 낭종과 감염된 신경 세포 사이의 공간 관계는 시간, 기술적으로 어려운 소비하고, 중요한 정보의 손실을 초래할 수있는 시리얼 재건을 필요로한다. 따라서, 우리는 CNS의 톡소 플라즈마 증의 마우스 모델을 사용하고 EM 또는 면역 조직 화학 (IHC)없이 이미지에 감염된 신경 세포의 전체를 우리를 허용 할 수있는 방법을 개발했다. 이러한 기술을 개발함으로써, 우리는 상대적으로 신속하고 저렴한 방법으로 감염된 세포와 낭종 사이의 세포의 관계를 탐구하기 시작할 수 있습니다.
우리가 개발 한 방법은 기생충 단백질 9,10 주입 된 생체 세포에 표시하는 시스템과 공 초점 현미경 (8)에 의해 광학적으로 청소 및 이미징 두꺼운 뇌 섹션에 대한 새로운 기술을 결합합니다. 이 시스템에서는, 톡소와 재결합 11 치운다 매개 된 후에 만 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 치운다 리포터 생쥐에 감염 </em> 적색 형광 단백질 (RFP)를 표현하고 숙주 세포 (9)에 Cre 호텔 재조합 효소를 주입 계통. 이 조합은 중추 신경계 감염이 설정된 후, 감염된 마우스의 뇌를 수확 두께 뇌 부분을 잘라 빠르게 RFP + 낭종을 찾아 이미지에 관련된 영역을 식별 할 수있게 해준다. 또한 GFP의 숙주 세포 발현 GFP + 세포의 수는 10 기생충을 포함하지 않는, 기생충 감염에 의해 Cre 호텔의 주입에 전적으로 의존하지 같이 것을 주목하는 것이 중요하다. 이 프로토콜의 목적은 화상 전체의 감염된 뉴런 할 수 있도록하기 때문에, 초점은 GFP + 또한 RFP + 낭종이 포함 뉴런이지만, 프로토콜은 또한 이미지에 GFP + / RFP를 사용할 수 – 뉴런.
감염된 뇌 수확 및 절단되면, 섹션은 글리세롤 청산에 의해 투명하게 렌더링됩니다. 섹션들의 적절한 영역이어서 초점 현미경, 알을 촬상감염된 숙주 세포 및 그 전체 포낭 기생충과 같은 전례 시각화. 여기서 우리는 식별을위한 완전한 프로토콜, 광학 청소, 및 이미징 감염된 신경 세포를 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
감염된 숙주 세포에서 세포 변화는 HIV, 광견병, 클라미디아 (18, 19)와 같은 다른 세포 생물과 감염 질환의 결과에 연결되어 있음을 감안할 때, 우리는 우리가 CNS 사이에 발생하는 친밀한 상호 작용을 연구 할 수 있도록 해주는 기술을 개발 세포 및 톡소 플라스마를 개최. 여기에 기재된 방법은 만성 감염 뉴런의 효율적인 이미징을 가능하게함으로써 이러한 목표를 달성한다. 이 방법?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 도움이 토론 전체 Koshy 실험실 감사합니다. 우리는 패티 Jansma과 조언을 애리조나 신경 과학학과의 대학 감사 및 이미징에 도움이됩니다. 우리는 또한 자신에 vibratome의 사용을 Porreca 실험실 감사합니다. 이 연구는 미국 국립 보건 연구소 (NIH NS065116, AAK)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vibratome Series 1000 Sectioning System | Technical Products International, Inc. | Other vibratomes are compatible | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Premium Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| #1.5 Coverslips | VWR | 48393 251 | |
| Diamond Scriber | VWR | 52865-005 | |
| Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
| AnaSed® Injection Xylazine 20mg/ml | Lloyd Inc. | ||
| ZsGreen Mice | Jackson Laboratories | 7906 | B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| Surgical equipment | Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula. | ||
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | These are primary cells from human foreskins. We make these in-house but they may be purchased from outside vendors. | ||
| Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| 200mM L-alanyl-L-glutamine | Corning | 25-015-Cl | |
| 25cm2 Canted neck flask | Fisher Scientific | 1012639 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | VWR | 45000-446 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade | amresco | K813-500ml | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
| Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 20ml Disposable Scintillation Vials | Fisher Scientific | FS74500-20 | |
| Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof | In-house | 17212945 | This product is purchased from an in-house stockroom. Other companies are compatible. |
| Imaris Software | Bitplane | ||
| Clear nail polish | Other brands are compatible | ||
| 10ml Syringe with Luer-Lok | VWR | BD309604 | Other syringes are compatible |
| Three-way Stopcock | Any brand is compatible | ||
| Hypodermic needle | Any brand is compatible – used to pin down mouse. | ||
| Cell Scraper | Any brand is compatible | ||
| 25G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter | Greiner Bio-One | 450099 | Other brands are compatible |
References
- Luft, B., Remington, J. Toxoplasmic encephalitis in AIDS. Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).
- Hill, D., Dubey, J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention. Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).
- Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance. PloS one. 8 (9), 75246 (2013).
- Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -. P., Sapolsky, R. M. Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats. Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).
- Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).
- Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study. Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).
- Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study. J Neuroparasitology. , (2010).
- Selever, J., Kong, J. -. Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. (53), (2011).
- Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions. Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).
- Koshy, A. a., Dietrich, H. K., et al. Toxoplasma co-opts host cells it does not invade. PLoS pathog. 8 (7), (2012).
- Madisen, L., Zwingman, T. a., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
- Caffaro, C. E., Koshy, A. s., Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites. PLoS pathog. 9 (5), (2013).
- Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host. Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).
- Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts. Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 .
- Prandota, J. Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).
- Berenreiterová, M., Flegr, J., Kuběna, A., Němec, P. The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis. PloS one. 6 (12), 28925 (2011).
- Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice. Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).
- De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).
- Scott, C. a., Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice. J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).
- Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
