Summary

Nöronlar 3-D Görüntüleme ve Analiz Enfekte<em> İn Vivo</em> Ile<em> Toxoplasma gondii</em

Published: December 09, 2014
doi:

Summary

Bu protokolü kullanarak, biz görselleştirme ve encysting parazitin enfekte nöron arasındaki mekansal ilişkinin analizini sağlayan parazit Toxoplasma gondii ile enfekte farelerde görüntü 160 mikron kalınlığında beyin bölümlerine başardık.

Abstract

Toxoplasma gondii, insanlarda ve kemirgenler dahil olmak üzere, geniş bir konak yelpazesi ile bir obligat hücre içi parazit. Hem insanlarda hem de kemirgenler ise, Toxoplasma beyinde bir ömür boyu kalıcı enfeksiyon oluşturur. Bu beyin enfeksiyonu gelişmekte olan fetus ya da beyinde kazanılmış bağışıklık yetmezliği sendromu (AİDS) hasta için bu tercihte ve sebat gibi bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde, çoğu immün sistemi kişilerde asemptomatik iken yıkıcı nörolojik hastalığa yol açabilir. Böylece,-beyin-Toxoplasma etkileşim Toksoplazma tarafından üretilen semptomatik hastalığı kritik, henüz biz merkezi sinir sistemi (MSS) ve parazit hücreleri arasındaki hücresel veya moleküler etkileşim az bir anlayışa sahip olduğu açıktır. CNS fare modelinde bu nöronlar parazit devam ettiği hücreler 30 yıldır bilinmektedir toksoplazmozis, ama çok az bilgi hangi kullanılabilirnöronun parçası genellikle (soma, dendrit, akson) bulaşmış ve bu hücresel ilişki suşları arasında değişir eğer. Bölümünde, bu eksikliği görüntüleme zorluk sekonder ve bir hayvandan bütün enfekte nöronlar görselleştirme olduğunu. Bu tür görüntüler tipik seri kesitlerinin ve elektron mikroskobu veya immün sonra konfokal mikroskobu ile görüntülü doku dikiş gerektirir. Çeşitli teknikler birleştirerek, burada açıklanan yöntem immün gerek kalmadan üç boyutlu görselleştirme ve bireysel, kronik olarak enfekte nöronların analizini sağlayan, tespit ve kistler içeren görüntü tüm hücreleri kalın bölümlerin kullanımını (160 mikron) sağlayan, elektron mikroskobu veya seri kesit ve dikiş. Bu tekniği kullanarak, parazit ve enfekte nöron arasındaki hücresel ilişkiyi anlamak başlayabilirsiniz.

Introduction

Bu yöntemin genel amacı yüksek çözünürlük, zorunlu hücre içi parazit Toxoplasma gondii ile enfekte olan bireysel nöronlar üç boyutlu görüntüler elde etmektir.

Toksoplazma sık sık insanları ve kemirgenler içeren geniş ara konak aralığı, en başarılı parazitlerin biri olarak kabul edilir. Insanlarda ve kemirgenler hem de, kontamine yiyecek veya su tüketilmesi yoluyla akut enfeksiyondan sonra, Toxoplasma formunu yavaş-kopyalayan onun hızlı kopyalayan formu (tachyzoite) dönüştürme ve encysting ile MSS kalıcı enfeksiyona neden yapabiliyor (bradyzoite ). Bağışıklığa sahip bireylerde bu gizli merkezi sinir sistemi enfeksiyonu nispeten asemptomatik olduğu düşünülmektedir, ancak, AİDS hastalarında ya da transplant alıcıları gibi bağışıklık sistemi baskılanmış kişilerde, parazitin açılma ölümcül Toksoplazma ensefalit 1,2 yol açabilir. Buna ek olarak, son çalışmalar hamekanizma bilinmemektedir olsa Toksoplazma latent infeksiyon, kemirgenler 3,4 davranışsal değişikliklere yol açabilir göstermiştir ettik.

Şaşırtıcı, CNS- Toxoplasma etkileşimin önemini vurgulayarak, bu verilere rağmen, nispeten daha az, özellikle hücresel ve moleküler düzeyde, bu ilişki hakkında bilinmektedir. Beyin-parazit etkileşimi bile basit yönlerini incelemek için yeteneği teknolojik sınırlamalar kısmen engel olmuştur. Örneğin, işin çoğunluğu nöronlar kistler elektron mikroskobu (EM) 5,6 ile yapılmıştır devam ettiği hücrelerin olduğunu gösteren. EM yüksek çözünürlük verir rağmen, zaman alıcı, emek yoğun ve pahalı. İmmünofloresan (IF) tahlilleri son zamanlarda EM 7 tarafından yapılan işi onaylamak için konfokal mikroskobu ile birlikte kullanılmıştır. Deneyleri gerçekleştirmek için teknik olarak kolay ve nispeten ucuz, ama under bu teknikleri kullanarak IFtand kist ve enfekte nöron arasındaki mekansal ilişki süresi, teknik olarak zor alıcı ve değerli bilgiler kaybına yol açabilir seri rekonstrüksiyon gerektirir. Böylece, biz MSS toksoplazma fare modeli ile kullanılan ve EM veya immünohistokimyasal (İHK) olmadan görüntü enfekte nöronların tamamını bize izin verir edilebilir bir yöntem geliştirdik. Böyle bir teknik geliştirerek, biz nispeten hızlı ve ucuz bir şekilde enfekte hücre ve kist arasındaki ilişkiyi keşfetmeye hücresel başlayabilirsiniz.

Geliştirdiğimiz yöntem parazit proteinleri 9,10 ile enjekte edilmiş in vivo hücrelerinde işaretleri bir sistem ile konfokal mikroskopi 8 ile optik takas ve görüntüleme kalın beyin bölümleri için yeni teknikler birleştirir. Bu sistemde, Toksoplazma rekombinasyonu 11 Kre-aracılı sonra yeşil floresan protein (GFP) ifade Cre raportör fareleri enfekte </em> Kırmızı floresan proteini (RFP) ifade konak hücrelere 9 içine Cre recombinase enjekte suşları. Bu kombinasyon MSS enfeksiyonu kurulduktan sonra, enfekte fare beyin hasat kalın beyin bölümleri kesip, hızla RFP + kistleri bularak görüntüye uygun alanları belirlemek için bize izin verir. Bu GFP konakçı hücre GFP + hücrelerinin sayısı parazitleri 10 içermez, enfeksiyon parazitlerin Cre enjeksiyon yalnızca bağlıdır olup olarak dikkat etmek önemlidir. Bu protokolün amacı görüntü tüm enfekte nöronlar edebilmek için olduğu gibi, odak sadece GFP + ayrıca bir RFP + kist ihtiva nöronlar üzerinde, ancak protokol de görüntü GFP + / RFP kullanılabilir nöronlar.

Enfekte beyin hasat ve bölümlere sonra, bölümler gliserol takas yoluyla şeffaf hale getirilir. Bölümlerin uygun bölgeler daha sonra konfokal mikroskopi, arkadaşları ile görüntülüenfekte olmuş bir ev sahibi hücreleri ve bunların bir bütün olarak, keseli parazitlerin belirtilenlerin benzeri görüntüleme. Burada bir tanımlama için tam protokol, optik takas ve görüntüleme enfekte nöronlar sağlamak.

Protocol

Not: Fareler, Arizona Üniversitesi, yiyecek ve su ad libitum ile ışık / karanlık döngüsü ters yetiştirilen 12 saat olan bir sıcaklık ve nem kontrollü bir odada muhafaza edildi. Deneyler kurallar ve Arizona Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayı altında gerçekleştirilmiştir. Tüm çabalar acı en aza indirmek için yapılmıştır. Kre-raportör fareler, C57BL / 6 arka 11 ve ticari olarak temin edilebilir. 1. Fare Enfeksiyon <p cl…

Representative Results

Şekil 7, A ve B, bu yeni olduğu kist içeren iki farklı 160 mikron kalınlığında kesitler aynı zamanda Şekil 7B'de kist-hücre vücut mesafenin bir temsili ölçüm. Şekil gelen GFP + nöronlar göstermektedir Şekil 7, iki temsili görüntüleri içerir Protokol, bir bütün olarak enfekte nöron olarak gösterebilir. Şekil 7C, bu görüntüleme tekniği ile birlikte, kist ve hücre gövdesi (I…

Discussion

Enfekte konak hücrelerde hücresel değişiklikler gibi HIV, kuduz, ve Chlamydia 18,19 gibi diğer hücre içi organizmalar ile enfeksiyonlarda hastalık sonuçları ile bağlantılı olduğunu göz önüne alındığında, bize MSS arasında meydana samimi etkileşimleri çalışmak için izin verecek bir teknik geliştirdi hücre ve Toxoplasma ev sahipliği. Burada anlatılan yöntem kronik olarak enfekte nöronların verimli görüntüleme sağlayarak bu hedefe gerçekleştirir. Bu yöntemin geli…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz yararlı tartışmalar için tüm Koshy laboratuar teşekkür ederim. Biz Patty Jansma ve tavsiye için Arizona Sinirbilim Anabilim Dalı Üniversitesi teşekkür ve görüntüleme yardım. Biz de onların Vibratome kullanımı için Porreca laboratuar teşekkür ederiz. Bu araştırma ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH NS065116, AAK) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Vibratome Series 1000 Sectioning System Technical Products International, Inc. Other vibratomes are compatible
Glycerol Fisher Scientific BP229-1
Tween-20 Fisher Scientific BP337-500
Premium Slides Fisher Scientific 12-544-2
#1.5 Coverslips VWR 48393 251
Diamond Scriber VWR 52865-005
Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope Zeiss LSM 510
Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml Western Medical Supply, Inc. 4165
AnaSed® Injection Xylazine 20mg/ml Lloyd Inc.
ZsGreen Mice Jackson Laboratories 7906 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J
Surgical equipment Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula.
Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells These are primary cells from human foreskins.  We make these in-house but they may be purchased from outside vendors.
Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) HyClone SH30081.01
Penicillin Streptomycin Solution, 100X Corning 30-002-Cl
200mM L-alanyl-L-glutamine Corning 25-015-Cl
25cm2 Canted neck flask Fisher Scientific 1012639
Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium VWR 45000-446
Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade amresco K813-500ml
Fetal Bovine Serum Gibco 26140-079
Bright-Line Hemocytometer Sigma-aldrich Z359629-1EA
Mouse Brain Slicer Matrix Zivic Instruments BSMAS005-1
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-1
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-aldrich H3393-100KU
Paraformaldehyde Fisher Scientific O4042-500
20ml Disposable Scintillation Vials Fisher Scientific FS74500-20
Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof In-house 17212945 This product is purchased from an in-house stockroom.  Other companies are compatible.
Imaris Software Bitplane
Clear nail polish Other brands are compatible
10ml Syringe with Luer-Lok VWR BD309604 Other syringes are compatible
Three-way Stopcock Any brand is compatible
Hypodermic needle Any brand is compatible – used to pin down mouse.
Cell Scraper Any brand is compatible
25G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter Greiner Bio-One 450099 Other brands are compatible

References

  1. Luft, B., Remington, J. Toxoplasmic encephalitis in AIDS. Clin Infect Dis. 15 (2), 211-222 (1992).
  2. Hill, D., Dubey, J. P. Toxoplasma gondii: transmission, diagnosis and prevention. Clin Microbiol Infect. 8 (10), 634-640 (2002).
  3. Ingram, W. M., Goodrich, L. M., Robey, E., Eisen, M. B. Mice infected with low-virulence strains of Toxoplasma gondii lose their innate aversion to cat urine, even after extensive parasite clearance. PloS one. 8 (9), 75246 (2013).
  4. Evans, A. K., Strassmann, P. S., Lee, I. -. P., Sapolsky, R. M. Patterns of Toxoplasma gondii cyst distribution in the forebrain associate with individual variation in predator odor avoidance and anxiety-related behavior in male Long-Evans rats. Brain Behav Immun. 37, 122-133 (2013).
  5. Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. The host-parasite relationship of Toxoplasma gondii in the brains of chronically infected mice. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol. 411 (1), 39-43 (1987).
  6. Ferguson, D. J., Graham, D. I., Hutchison, W. M. Pathological changes in the brains of mice infected with Toxoplasma gondii: a histological, immunocytochemical and ultrastructural study. Int J Exp Pathol. 72 (4), 463-474 (1991).
  7. Melzer, T. C., Cranston, H. J., Weiss, L. M., Halonen, S. K. Host Cell Preference of Toxoplasma gondii Cysts in Murine Brain: A Confocal Study. J Neuroparasitology. , (2010).
  8. Selever, J., Kong, J. -. Q., Arenkiel, B. R. A rapid approach to high-resolution fluorescence imaging in semi-thick brain slices. J Vis Exp. (53), (2011).
  9. Koshy, A., Fouts, A., Lodoen, M., Alkan, O. Toxoplasma secreting Cre recombinase for analysis of host-parasite interactions. Nat Methods. 7 (4), 307-309 (2010).
  10. Koshy, A. a., Dietrich, H. K., et al. Toxoplasma co-opts host cells it does not invade. PLoS pathog. 8 (7), (2012).
  11. Madisen, L., Zwingman, T. a., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
  12. Caffaro, C. E., Koshy, A. s., Liu, L., Zeiner, G. M., Hirschberg, C. B., Boothroyd, J. C. A nucleotide sugar transporter involved in glycosylation of the Toxoplasma tissue cyst wall is required for efficient persistence of bradyzoites. PLoS pathog. 9 (5), (2013).
  13. Saeij, J. P. J., Boyle, J. P., Boothroyd, J. C. Differences among the three major strains of Toxoplasma gondii and their specific interactions with the infected host. Trends in parasitology. 21 (10), 476-481 (2005).
  14. Dubey, J. P., Lindsay, D. S., Speer, C. a Structures of Toxoplasma gondii tachyzoites, bradyzoites, and sporozoites and biology and development of tissue cysts. Clin Microbiol Rev. 11 (2), 267-299 .
  15. Prandota, J. Possible Link Between Toxoplasma Gondii and the Anosmia Associated With Neurodegenerative Diseases. Am J Alzheimers Dis Other Demen. 29 (3), 205-214 (2014).
  16. Berenreiterová, M., Flegr, J., Kuběna, A., Němec, P. The distribution of Toxoplasma gondii cysts in the brain of a mouse with latent toxoplasmosis: implications for the behavioral manipulation hypothesis. PloS one. 6 (12), 28925 (2011).
  17. Ferguson, D. J., Hutchison, W. M. An ultrastructural study of the early development and tissue cyst formation of Toxoplasma gondii in the brains of mice. Parasitol Res. 73 (6), 483-491 (1987).
  18. De Chiara, G., Marcocci, M. E., et al. Infectious agents and neurodegeneration. Mol Neurobiol. 46 (3), 614-638 (2012).
  19. Scott, C. a., Rossiter, J. P., Andrew, R. D., Jackson, A. C. Structural abnormalities in neurons are sufficient to explain the clinical disease and fatal outcome of experimental rabies in yellow fluorescent protein-expressing transgenic mice. J Virol. 82 (1), 513-521 (2008).
  20. Ke, M. -. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).

Play Video

Cite This Article
Cabral, C. M., Koshy, A. A. 3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii. J. Vis. Exp. (94), e52237, doi:10.3791/52237 (2014).

View Video