感染ニューロンの3-Dイメージングと分析<em>インビボ</em>と<em>トキソプラズマ</em
Summary
このプロトコルを使用して、我々は、シスト化の寄生虫と感染したニューロン間の空間的関係の可視化と分析を可能にする寄生虫トキソプラズマに感染したマウスからの画像160の厚さの脳切片することができました。
Abstract
トキソプラズマは、ヒト及びげっ歯類を含む広い宿主範囲、との偏性細胞内寄生虫である。ヒトとげっ歯類の両方で、 トキソプラズマは脳内の生涯持続感染を確立します。この脳の感染はほとんどの免疫担当の人で無症候性ですが、発育中の胎児や、後天性免疫不全症候群（AIDS）患者などの免疫無防備状態の個体では、脳内のためと永続この偏愛は壊滅的な神経疾患につながることができます。このように、脳- トキソプラズマ相互作用はトキソプラズマによって生成症候性疾患に重要である、まだ我々は、中枢神経系（CNS）および寄生虫の細胞との間の細胞または分子相互作用をほとんど理解していることは明らかである。 CNSのマウスモデルでは、それが神経細胞は寄生虫が解決している細胞であることを30年以上にわたって知られているが、ほとんど情報がどの程度利用可能であるトキソプラズマ症ニューロンの一部は、一般的に（ソーマ、樹状突起、軸索）を感染していると、この細胞の関係は、株の間で変更された場合。一部では、この欠如は、撮像の困難に二次であり、動物からの全感染ニューロンを可視化する。このような画像は、典型的には、連続切片および電子顕微鏡または免疫染色後に共焦点顕微鏡で画像化した組織のステッチを必要とするであろう。いくつかの技術を組み合わせることにより、ここで説明する方法は、免疫染色を必要とせずに個体、慢性的に感染した神経細胞の三次元可視化および解析を可能にする、厚い部分（160ミクロン）の使用は、嚢胞を含む全細胞を同定し、画像を可能にする、電子顕微鏡法、または連続切片とステッチ。この技術を用いて、寄生虫、感染したニューロン間の細胞の関係を理解し始めることができます。
Introduction
この方法の全体的な目標は、高解像度、偏性細胞内寄生トキソプラズマ原虫に感染した個々のニューロンの三次元画像を得ることである。
トキソプラズマは、しばしば人間とげっ歯類が含まれ、その大きな中間宿主域、の中で最も成功した寄生虫の一つと考えられている。ヒトとげっ歯類の両方で、汚染された食物や水の摂取を通じて、急性感染後、 トキソプラズマがフォームをそのスロー複製にその速い複製形（タキゾイト）からの変換とシスト化によってCNSの持続感染を引き起こすことが可能である（ブラディゾイト）。免疫応答性個体では、この潜在的な中枢神経系の感染は比較的無症候性であると考えられているが、そのようなエイズ患者や移植レシピエントとして免疫無防備状態の個体では、寄生虫の再燃は、致命的なトキソプラズマ脳炎1,2につながることができます。加えて、最近の研究ヘクタールメカニズムは不明であるもののトキソプラズマと潜伏感染は、げっ歯類3,4における行動の変化につながる可能性があることを示したVEの。
驚くべきことに、CNS- トキソプラズマ相互作用の重要性を強調し、これらのデータにもかかわらず、比較的少ない、特に、細胞および分子レベルで、この関係について知られている。脳寄生虫相互作用のさえ単純な側面を研究する能力は、科学技術の限界によって一部に妨げられてきた。例えば、ニューロンは、嚢胞が持続する細胞であることを示す研究の大半は、電子顕微鏡（EM）5,6を用いて行われてきた。 EMは、高解像度を与えるが、それは時間がかかり、労働集約的で、かつ高価である。免疫蛍光（IF）アッセイは、最近、EM 7によって行われた作業を確認するために、共焦点顕微鏡と組み合わせて使用されてきた。アッセイは、実行することが技術的に容易で、比較的安価な、しかしアンダーにこれらの技術を使用している場合嚢胞、感染したニューロン間の空間的関係は、時間がかかるもの、シリアル再建を必要とする技術的に困難であり、貴重な情報の損失につながる可能性がTAND。したがって、我々は、CNSトキソプラズマ症のマウスモデルで使用し、EMまたは免疫組織化学（IHC）のない画像に感染した神経細胞の全体を私たちを可能にすることができる方法を開発した。このような技術を開発することにより、我々は、比較的迅速かつ安価な方法で感染細胞とシストの間に細胞の関係を探求し始めることができます。
私たちが開発した方法は、寄生虫タンパク質9,10に注入された生体細胞内のマークシステムと共焦点顕微鏡8による光学的にクリアとイメージング厚い脳切片の新しい技術を組み合わせたものです。このシステムでは、我々はトキソプラズマとのCre介在組換え後の11緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現するのCreレポーターマウスを感染</em>赤色蛍光タンパク質（RFP）を発現する宿主細胞9にCreリコンビナーゼを注入菌株。この組み合わせは、私たちはCNS感染が確立された後、感染したマウスの脳を収穫厚い脳切片を切断し、そして迅速にRFP +嚢胞を見つけることによって、画像に関 連する領域を特定することができる。これは、GFPの宿主細胞発現はGFP +細胞の数は、寄生虫10が含まれていない、感染に寄生虫のCreの注入のみに依存する、としないように留意することが重要である。ニューロン–このプロトコルの目的は、画像全体に感染したニューロンにできることがあるので、焦点は唯一のもRFP +嚢胞が含まれていますが、プロトコルは、GFP + / RFPイメージにも使用することができ、GFP +ニューロンにある。
感染した脳を採取し、区分された後、切片をグリセロールクリアで透明なレンダリングされます。セクションの適切な領域は、その後、共焦点顕微鏡、らで撮像する感染した宿主細胞、および、それらの全体がシスト寄生虫のlowing前例のない可視化。ここでは、識別するための完全なプロトコル、光学的にクリアリング、およびイメージング感染ニューロンを提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
感染した宿主細胞における細胞変化は、HIV、狂犬病、およびクラミジア18,19などの他の細胞内生物による感染症の疾患転帰にリンクされていることを考えると、私たちは私たちがCNSとの間で発生する親密な相互作用を研究することを可能にする技術を開発セルおよびトキソプラズマを開催。ここで説明する方法は、慢性的に感染した神経細胞の効率的なイメージングを可能にす…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は有用な議論のための全体Koshyラボを感謝。私たちは、イメージングとのアドバイスや助けをパティジャンスマとアリゾナ大学の神経科学省に感謝します。我々はまた、彼らのビブラトームを使用するためのPorrecaラボに感謝。この研究は、米国国立衛生研究所（NIH NS065116、AAK）によってサポートされていました。
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Vibratome Series 1000 Sectioning System | Technical Products International, Inc. | Other vibratomes are compatible | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Premium Slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| #1.5 Coverslips | VWR | 48393 251 | |
| Diamond Scriber | VWR | 52865-005 | |
| Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope | Zeiss | LSM 510 | |
| Ketaject® Ketamine HCl Inj., USP 100mg/ml | Western Medical Supply, Inc. | 4165 | |
| AnaSed® Injection Xylazine 20mg/ml | Lloyd Inc. | ||
| ZsGreen Mice | Jackson Laboratories | 7906 | B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm6(CAG-ZsGreen1)Hze/J |
| Surgical equipment | Thumb forceps; Fine scissors-angled to side, sharp-sharp; Sharp-sharp scissors; Kelly hemostats; Mayo scissors; Micro spatula. | ||
| Human Foreskin Fibroblasts (HFF) cells | These are primary cells from human foreskins. We make these in-house but they may be purchased from outside vendors. | ||
| Dulbecco's High Glucose Modified Eagles Medium (DMEM) | HyClone | SH30081.01 | |
| Penicillin Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| 200mM L-alanyl-L-glutamine | Corning | 25-015-Cl | |
| 25cm2 Canted neck flask | Fisher Scientific | 1012639 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | VWR | 45000-446 | |
| Phosphate-Buffered Saline, 10X, USP Sterile Ultra Pure Grade | amresco | K813-500ml | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140-079 | |
| Bright-Line Hemocytometer | Sigma-aldrich | Z359629-1EA | |
| Mouse Brain Slicer Matrix | Zivic Instruments | BSMAS005-1 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-aldrich | H3393-100KU | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | O4042-500 | |
| 20ml Disposable Scintillation Vials | Fisher Scientific | FS74500-20 | |
| Alcohol, Ethyl, 95%, 190 Proof | In-house | 17212945 | This product is purchased from an in-house stockroom. Other companies are compatible. |
| Imaris Software | Bitplane | ||
| Clear nail polish | Other brands are compatible | ||
| 10ml Syringe with Luer-Lok | VWR | BD309604 | Other syringes are compatible |
| Three-way Stopcock | Any brand is compatible | ||
| Hypodermic needle | Any brand is compatible – used to pin down mouse. | ||
| Cell Scraper | Any brand is compatible | ||
| 25G x 12" Tubing, Safety Blood Collection Set, with Luer Adapter | Greiner Bio-One | 450099 | Other brands are compatible |
References
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